李玲玲，羅合春，胡敏（重慶工貿(mào)職業(yè)技術學院生物化學工程系，重慶408000）

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人工培育冬蟲夏草分生孢子的研究

李玲玲，羅合春，胡敏
（重慶工貿(mào)職業(yè)技術學院生物化學工程系，重慶408000）

摘要：通過單因素試驗和正交試驗對冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基進行優(yōu)化，同時探討培養(yǎng)條件（溫度、光照和pH）對分生孢子產(chǎn)量的影響，確定冬蟲夏草菌產(chǎn)分生孢子的最佳條件。結(jié)果顯示：最佳的冬蟲夏草產(chǎn)孢子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，ZnCl20.09 g，組氨酸0.3 g，賴氨酸0.3 g，純牛奶200 mL，超純水補充至1 000 mL。最佳培養(yǎng)條件為：14℃、pH5.80、完全黑暗的環(huán)境下，培養(yǎng)40 d。在最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下，冬蟲夏草單菌落分生孢子產(chǎn)量達到2.98×105個，優(yōu)化后孢子產(chǎn)量是基礎培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量的3.6倍，明顯提高了分生孢子的產(chǎn)量。

關鍵詞：冬蟲夏草；分生孢子；培養(yǎng)基優(yōu)化

冬蟲夏草在我國有著悠久的藥用歷史，記載可追溯到一千年之前[1]。其有效成分主要有：核苷類化合物，氨基酸、多肽，多糖類，糖醇、甾醇類，脂肪酸、酯、烷烴，多胺類物質(zhì)，多種維生素等。具有免疫調(diào)節(jié)，保護腎臟、肝臟，抗菌、抗病毒、抗腫瘤，調(diào)節(jié)心血管、呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)功能，抗衰老、抗疲勞，降血糖等作用[2]。因此隨著人們生活水平的提高，對冬蟲夏草的需求越來越高，但天然冬蟲夏草由于生長條件特殊，產(chǎn)量低，再加上人們的過度采集，使得蟲草資源已經(jīng)瀕臨滅絕。冬蟲夏草人工培育成為解決這一問題的有效途徑之一。

國內(nèi)關于冬蟲夏草人工培養(yǎng)進行了一些研究[3-8]，這些研究主要集中在如何通過液體發(fā)酵和固體發(fā)酵的方法提高其菌絲體或活性成分的產(chǎn)量，關于冬蟲夏草分生孢子的研究也有報道，有人研究了不同因子對冬蟲夏草真菌產(chǎn)生分生孢子的影響[9]，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草真菌在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、小麥培養(yǎng)基產(chǎn)生分生孢子較多，同時溫度在15℃～18℃，完全黑暗條件下分生孢子產(chǎn)生較多。王燦研究了不同的溫度條件下中國被毛孢分生孢子的形成數(shù)量和時間的變化，確定了產(chǎn)生分生孢子數(shù)量最大的時間是培養(yǎng)30d[10]。此前課題組已經(jīng)研究了不同微量元素和生長因子對冬蟲夏草分生孢子產(chǎn)量的影響[11]，在此基礎上進一步研究碳源、氮源、添加物對冬蟲夏草分生孢子產(chǎn)量的影響，確定最佳碳源、氮源和添加物，并試圖通過正交試驗，確定最佳的冬蟲夏草產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，為篩選冬蟲夏草產(chǎn)孢子培養(yǎng)基提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1菌種

冬蟲夏草菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2接種與培養(yǎng)

用滅菌的手術刀將冬蟲夏草菌落邊緣灰白色部分切割成約2 mm的菌塊；用無菌接種鏟將切好的菌塊分別接種在各種平板上，每個平板接種5塊，封口膜封住培養(yǎng)皿。

接種后的平板放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：完全黑暗、18℃，培養(yǎng)過程中定期觀察生長情況，培養(yǎng)一段時間后，觀察菌落形態(tài)、量取菌落直徑，并在光學顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。

1.3分生孢子的收集及計數(shù)

在每一平板中加入20 mL 0.1 %的吐溫80溶液，用接種環(huán)輕輕刮取菌落上的分生孢子，收集于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL 0.1 %的吐溫80溶液將孢子制成懸液，渦旋振蕩儀充分振蕩，血球計數(shù)板計數(shù)單菌落產(chǎn)生的孢子數(shù)，4次重復。

1.4單因素試驗

基礎培養(yǎng)基配方：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，純牛奶200 mL，補充超純水至1 000 mL，初始pH5.60～6.00。

在基礎培養(yǎng)基配方的基礎上，分別改變碳源、氮源、添加物，添加不同的微量元素和氨基酸，每1 000 mL培養(yǎng)基中，改變碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖各30 g；改變氮源：蛋白胨、酵母粉、麩皮、蠶蛹粉、魚粉各10 g；改變添加物：馬鈴薯200 g、鮮牛奶200 mL、無添加物牛奶和馬鈴薯；

添加微量元素：基礎培養(yǎng)基中分別添加0.001 %不同種類的微量元素，4種微量元素分別為：CuSO4· 5H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，ZnCl2；

添加氨基酸：在基礎培養(yǎng)基中分別添加0.01 %不同種類的氨基酸，8種氨基酸分別為：賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、組氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、絲氨酸。為防止氨基酸失活，培養(yǎng)基配制時，基礎培養(yǎng)基和氨基酸溶液分開滅菌，基礎培養(yǎng)基采用1×105Pa滅菌30 min；1 %氨基酸溶液采用過濾的方法滅菌，然后按照一定比例在基礎培養(yǎng)基中分別添加8種過濾好的氨基酸溶液，使氨基酸在培養(yǎng)基中的含量達到0.01 %。

每個處理3個培養(yǎng)皿，將冬蟲夏草菌塊接種在不同處理的培養(yǎng)基上后，置于完全黑暗、18℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 d，測定分生孢子產(chǎn)量。

1.5數(shù)據(jù)分析

單因素試驗得到的數(shù)據(jù)采用Excel 2007和統(tǒng)計軟件DPS7.01中的新復極差法分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

1.6正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取能明顯促進分生孢子產(chǎn)量提高的無機鹽和氨基酸，設計四因素三水平進行正交試驗復選，確定最佳產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基配方。

1.7收獲時間的確定

正交試驗的過程中，研究分生孢子產(chǎn)量隨時間變化的情況。在1號～9號處理的培養(yǎng)基上接種冬蟲夏草菌塊，在完全黑暗、18℃的環(huán)境下，分別培養(yǎng)至不同的天數(shù)，檢測分生孢子產(chǎn)量，每次檢測3個培養(yǎng)皿，3次重復。

1.8培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.8.1培養(yǎng)溫度對產(chǎn)孢水平的影響

按照正交試驗得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH為5.80，滅菌后接種冬蟲夏草菌塊，在完全黑暗的條件下，分別放于18、14℃培養(yǎng)，每個處理3個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)至40 d時，檢測分生孢子產(chǎn)量。

1.8.2初始pH對產(chǎn)孢水平的影響

用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)配最優(yōu)培養(yǎng)基的pH，分別以4.60、5.20、5.80、6.40、7.00 5個不同初始pH作處理，在14℃、完全黑暗的條件下培養(yǎng)40 d，檢測分生孢子產(chǎn)量。

1.8.3光照對產(chǎn)孢水平的影響

采用正交試驗得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，調(diào)節(jié)初始pH 5.80，在14℃條件下，設12 h/12 h（光照/黑暗）交替培養(yǎng)、連續(xù)24 h黑暗培養(yǎng)2個處理，培養(yǎng)40 d，明確光照是否對產(chǎn)孢水平有影響。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

對各處理培養(yǎng)基上的分生孢子進行計數(shù)，數(shù)據(jù)采用Excel 2007和統(tǒng)計軟件DPS7.01中的新復極差法進行差異顯著性分析，結(jié)果見表1。

表1各單因素對冬蟲夏草分生孢子產(chǎn)量的影響Table 1 The effect of different single-factor on the conidia production

續(xù)表1各單因素對冬蟲夏草分生孢子產(chǎn)量的影響Continue table 1 The effect of different single-factor on the conidia production

不同氮源之間和不同氨基酸之間分生孢子產(chǎn)量差異極顯著，酵母粉為氮源時單菌落分生孢子產(chǎn)量最高；添加了組氨酸的基礎培養(yǎng)基，分生孢子產(chǎn)量最高，其次是賴氨酸。不同微量元素之間分生孢子產(chǎn)量差異顯著，研究中選取了FeSO4·7H2O和ZnCl2兩種無機鹽用于正交試驗。不同碳源之間和不同添加物之間分生孢子產(chǎn)量無顯著性差異，研究中選擇了孢子產(chǎn)量稍高于其它兩種碳源的葡萄糖作為碳源；考慮到使用上的方便，選擇了純牛奶作為添加物。

2.2培養(yǎng)基優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

選取能促進分生孢子產(chǎn)量提高的無機鹽FeSO4· 7H2O、ZnCl2和生長因子組氨酸、賴氨酸4個因素，設計L9（34）正交表，因素水平見表2。

表2冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of L9（34）for the culture medium of the conidia by orthogonal experiment

在基礎培養(yǎng)基中添加不同組合的4種組分，配制成9種不同的培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基3個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)40 d，計數(shù)分生孢子產(chǎn)量，結(jié)果見表3、表4。

由表3可以看出，培養(yǎng)基中4種組分含量的不同對分生孢子產(chǎn)量有一定的影響，其中組合A3B3C2D1（即9號處理）的單菌落分生孢子產(chǎn)量最高。同時從表3也可以看出，菌落直徑和孢子產(chǎn)量之間不呈正比關系，菌落直徑大的不一定比菌落直徑小的分生孢子產(chǎn)量高。由此說明，促進菌絲生長的組分與促進孢子產(chǎn)生的組分不太一樣。

表3 L9（34）正交試驗方案及結(jié)果Table 3 L9（34）orthogonal test and results

表4極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal experiment

從表4極差分析結(jié)果可以看出，對分生孢子產(chǎn)量影響大小的順序是ZnCl2＞FeSO4·7H2O＞賴氨酸＞組氨酸，對菌落直徑影響大小的順序是FeSO4·7H2O＞賴氨酸＞ZnCl2＞組氨酸，4種因素對二者影響大小不太一致。但總體上來看，微量元素比氨基酸對分生孢子產(chǎn)量和菌落直徑影響要大，是主要因素。同時得到有利于分生孢子產(chǎn)量提高的最優(yōu)組合為A2B3C2D2，此最佳培養(yǎng)基組合并不在實施的9個處理中（表3）。為了考察最優(yōu)條件的再現(xiàn)性，須進行驗證試驗。

將培養(yǎng)基最優(yōu)組合A2B3C2D2和正交表實施過程中出現(xiàn)的產(chǎn)量最高的組合A3B3C2D1（9號處理）做驗證試驗，將冬蟲夏草菌塊接種在此兩種培養(yǎng)基上后，在完全黑暗、18℃的環(huán)境下，培養(yǎng)40 d，分別收集分生孢子，血細胞計數(shù)板計數(shù)分生孢子產(chǎn)量。最優(yōu)組合A2B3C2D2的單菌落分生孢子產(chǎn)量為2.75×105個，9號處理在同條件下的產(chǎn)量為1.90×105個，最優(yōu)組合比正交試驗實施過程中9號處理的產(chǎn)量提高了44 %。

2.3最佳收獲時間的確定

培養(yǎng)時間對冬蟲夏草菌產(chǎn)孢量的影響見圖1。

圖1培養(yǎng)時間對冬蟲夏草菌產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of different days on the conidia production of Ophiocordyceps sinensis

由圖1可知，隨培養(yǎng)時間不同，冬蟲夏草菌單菌落分生孢子產(chǎn)量也不同。30 d到35 d，孢子產(chǎn)量增長最快，35 d到40 d，孢子產(chǎn)量增長緩慢，多數(shù)處理的孢子產(chǎn)量在40 d時達到最高；40 d開始，多數(shù)處理的培養(yǎng)基上孢子產(chǎn)量開始降低，個別處理孢子產(chǎn)量仍然有所增加，但增加的很少；43 d至45 d，孢子產(chǎn)量下降不是很明顯，45 d后孢子產(chǎn)量急劇下降（圖1）。因此將冬蟲夏草菌分生孢子收獲的最佳時間定為40 d。

2.4各培養(yǎng)條件對產(chǎn)孢量的影響

培養(yǎng)時間對冬蟲夏草菌產(chǎn)孢量的影響見表5。

表5培養(yǎng)時間對冬蟲夏草菌產(chǎn)孢量的影響Table 5 The effect of temperature，pH and light on the conidia production

由表5可知，14℃比18℃孢子產(chǎn)量高；冬蟲夏草菌產(chǎn)孢對pH要求比較嚴格，在pH5.80時產(chǎn)孢量最高，pH偏離0.6個單位以上時，產(chǎn)孢量急劇下降；連續(xù)黑暗的培養(yǎng)條件有利于冬蟲夏草菌產(chǎn)孢，12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)的產(chǎn)孢量比連續(xù)黑暗培養(yǎng)的產(chǎn)孢量顯著低，且在培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，40 d時光照培養(yǎng)的菌落中央部位顏色為褐色，連續(xù)黑暗培養(yǎng)的菌落顏色整體為白色，推測光照可能會導致冬蟲夏草菌的提前老化。

3　討論與結(jié)論

分生孢子是部分真菌無性繁殖的主要方式之一，不僅可以保證真菌一定的繁殖速度和繁殖量，而且也是某些致病真菌和寄生真菌侵入宿主的主要方式之一[12]。分生孢子的形成與培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分關系密切，關于最佳培養(yǎng)條件的確定，本研究主要探討了最佳收獲時間和最適培養(yǎng)溫度。本研究確定的最佳收獲時間為40 d，這一結(jié)果與文獻[10]報道的30天時分生孢子產(chǎn)量最高不同，原因可能為所采用的中國被毛孢菌株不同和培養(yǎng)基成分不同有關。培養(yǎng)基成分方面，除了重要的碳源和氮源外，微量元素和生長因子對真菌產(chǎn)生分生孢子也有一定的影響[11，13-14]。

本研究通過單因素試驗和正交試驗對冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基進行優(yōu)化，同時探討了培養(yǎng)條件（溫度、光照和pH）對分生孢子產(chǎn)量的影響，確定出了冬蟲夏草菌產(chǎn)分生孢子的最佳條件。最佳的冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30 g，酵母粉10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl1.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.05g，ZnCl20.09g，組氨酸0.3g，賴氨酸0.3 g，純牛奶200 mL，超純水補充至1 000 mL。最佳培養(yǎng)條件為：14℃、pH5.80、完全黑暗的環(huán)境下，培養(yǎng)40 d。優(yōu)化后分生孢子產(chǎn)量是優(yōu)化前的3.6倍，為進一步篩選冬蟲夏草產(chǎn)分生孢子培養(yǎng)基提供了一定的參考，也為今后冬蟲夏草人工培育的規(guī)模化、現(xiàn)代化生產(chǎn)奠定了一定的研究基礎。

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Research on the Artificial Cultivation of the Conidia by Ophiocordyceps Sinensis

LI Ling-ling，LUO He-chun，HU Min
（Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry&Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China）

Abstract：Using the single factor and the orthogonal test，the optimal culture medium for the conidia of Ophiocordyceps sinensis were studied. The effect of temperature，pH and light on the conidia production were also studied. The best culture medium recipe was：glucose 30 g，yeast extract 10 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，ZnCl20.09 g，histidine 0.3 g lysine 0.3 g，pure milk 200 mL，the ultrapure water added to 1 000 mL. The maximum conidia production was produced under the optimal conditions：temperature 14℃，pH 5.80 and complete darkness for 40 d. Under the conditions，the maximum conidia production was 2.98×105. After optimization，the conidia production was 3.6 times more than that of the basal culture medium. The conidia production was significantly increased after optimization，which might be beneficial to workload in scale up fermentation later.

Key words：Ophiocordyceps sinensis；conidia；medium optimization

收稿日期：2015-09-30

作者簡介：李玲玲（1980—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。

基金項目：重慶市教委科學技術研究項目（KJ112302）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.047