劉議蔚 張正海 曹亞從 趙 紅 王立浩 張寶璽

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒抗炭疽病主效基因的定位及標(biāo)記開發(fā)

劉議蔚 張正海 曹亞從 趙 紅 王立浩 張寶璽*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以高抗炭疽病的辣椒材料PBC932（Capsicum chinense）為父本，以感病辣椒材料77013（Capsicum annuum）為母本和回交親本，獲得包含220個和129個單株的BC3S1和BC4S1群體材料，通過對各群體進行尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）抗性鑒定和SNP（KASPar）分子標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)UN27353_1781標(biāo)記與辣椒綠熟期炭疽病抗性基因AnRGO5緊密連鎖，遺傳距離為2 cM。進一步利用標(biāo)記UN27353_1781對BC4S2群體124個單株進行分子標(biāo)記分型，選擇準(zhǔn)確率達(dá)92.9%，表明該標(biāo)記可有效用于辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記輔助育種。

辣椒；炭疽??；抗性；尖孢炭疽菌；KASPar標(biāo)記

辣椒炭疽病是由半知菌亞門刺盤孢屬（Colletotrichum spp.）內(nèi)的幾個種引起的全球性真菌病害，目前在世界各地均有發(fā)生，高溫高濕的條件下發(fā)病尤為嚴(yán)重（Hartman & Wang，1992；Voorrips et al.，2004），嚴(yán)重?fù)p害了辣椒的產(chǎn)量和商品價值。在我國，目前研究的炭疽病病菌主要有4種：尖孢炭疽菌（C. acutatum）、紅色炭疽菌（C. gloeosporioides）、黑點炭疽菌（C. capsici）和黑色炭疽菌（C. coccodes）。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，我國炭疽病引起的辣椒減產(chǎn)一般為13%～18%，嚴(yán)重時可達(dá)50%（林清 等，2005）。培育抗炭疽病品種是保證辣椒正常生產(chǎn)的重要措施，而利用分子標(biāo)記輔助育種是既經(jīng)濟又高效的途徑之一。

Mahasuk等（2016）利用PBC80衍生群體對炭疽病抗性相關(guān)QTL進行研究，定位到3個與辣椒成熟期抗性相關(guān)的主效QTL：RA80rP2、RA80rP3.1和RA80rHP1，且均被定位到了4號連鎖群相同位點，兩側(cè)最近的SNP標(biāo)記為BACSNP-4-63和BACSNP-4-60，這兩個標(biāo)記相距17 cM，遺傳距離稍遠(yuǎn)，在育種應(yīng)用中受到一定的限制。

此前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組利用尖孢炭疽菌對抗源材料PBC932綠果期的抗性基因進行了相關(guān)QTL定位，將主效基因AnRGO5初步定位到辣椒P5染色體末端InDel標(biāo)記和HpmsE116標(biāo)記之間，這兩個標(biāo)記間的遺傳距離為9.6 cM（Sun et al．，2015）。由于SNP標(biāo)記具有數(shù)量多、穩(wěn)定性強、多態(tài)性豐富等特點在標(biāo)記開發(fā)中越來越受到重視，目前基于SNP標(biāo)記開發(fā)的KASPar標(biāo)記覆蓋了辣椒整個基因組。該遺傳定位為進一步開發(fā)緊密連鎖的SNP標(biāo)記奠定重要基礎(chǔ)。

本試驗利用抗病親本PBC932和感病親本77013雜交并回交獲得BC3S1和BC4S1群體，并對回交群體進行炭疽病抗性鑒定，利用KASPar標(biāo)記對綠果期主效抗性基因區(qū)段的連鎖圖譜進行加密，找到與辣椒綠果期抗炭疽病主效基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，旨在為辣椒抗炭疽病輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)苯凡牧希?015年5月至2016年1月期間，以高抗炭疽病材料PBC932（Capsicum chinense）（亞洲蔬菜研究發(fā)展中心王添成博士饋贈）為父本，以感病材料77013（Capsicum annuum）（本所培育）為母本進行雜交，以77013為父本回交獲得BC3和BC4群體，利用初定位區(qū)段InDel標(biāo)記和HpmsE116標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇（MAS），同時結(jié)合表型抗性鑒定，從BC3和BC4群體中選出抗病雜合的單株BC3-1和BC4-17，再分別自交獲得包含220個單株的BC3S1群體和129個單株的BC4S1群體，兩個群體定植于廊坊秋季21號日光溫室。供試病原菌為尖孢炭疽菌（菌株Coll-153），由本所辣椒課題組分離鑒定。

1.2 病原菌接種

人工接種采用針刺法（Pin-pricking inoculation），參照Yoon和Park（2001）的方法，略有改動。將采收的綠熟期果實洗凈，用70%的酒精噴灑在果實表面進行滅菌處理，用微量注射器（Hamilton PB600-1，Repeating Dispenser，Reno，NV，USA）在果實表面刺入深1 mm、直徑0.4 mm的傷口，注入1 μL濃度為5×105個·mL-1分生孢子懸浮液，根據(jù)果實大小每個果實接種2～3個點，每個單株設(shè)置3次重復(fù)；將接種后的果實接種點向上放置在鋪有濕潤滅菌濾紙的塑料箱中，初期為加快病原菌侵染可提供相對高濕的環(huán)境，用保鮮膜將塑料箱密封，置于26 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d，濕度保持在98%以上；為減少后期爛果，2 d后揭開保鮮膜，蓋上塑料箱蓋子暗培養(yǎng)5 d，濕度降至90%左右。

1.3 炭疽病抗性分析

以PBC932、77013和F1單株作為對照，對BC3S1和BC4S1群體的接種果進行抗病性鑒定?？剐澡b定指標(biāo)為平均病斑直徑（O）。病斑直徑的測量標(biāo)準(zhǔn)為沒有發(fā)病的接種點病斑直徑記為0 mm，發(fā)病的接種點病斑直徑為病斑橫、縱徑的平均值。通過將群體的病斑數(shù)據(jù)與兩個親本及F1的病斑數(shù)據(jù)進行方差分析等比較，最終確定抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)為：抗?。≧）：0 mm≤O≤7 mm；中抗（MR）：7 mm＜O≤12 mm；感?。⊿）：O＞12 mm。

平均病斑直徑（O）=∑病斑直徑/接種點數(shù)

1.4 基因組DNA提取

采集兩個群體及對照的全部個體單株嫩葉，冷凍抽干磨成粉末，采用改良CTAB法提取干樣的全基因組DNA（Wang et al．，2005），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Biospec-nano微量分光光度計檢測所提DNA質(zhì)量和濃度。提取后的DNA置于深孔板中，硅膠蓋密封置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 KASPar反應(yīng)體系建立及引物篩選

本試驗采用的KASPar分子標(biāo)記由本所辣椒課題組同法國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院合作開發(fā)。KASPar標(biāo)記含有3條引物序列：A1、A2、C，其中C為反向互補序列，A1和A2只存在末端的SNP位點差異，在A1、A2的5′端分別連接各自的接頭序列：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′、5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，此兩端接頭序列能與Master Mix里帶有熒光的序列互補配對，

配對后會激發(fā)熒光。

KasPar引物預(yù)混體系（100 μL）為：位點特異引物A1 12 μL，位點特異引物A2 12 μL，共用引物C 30 μL，ddH2O 46 μL。PCR擴增體系（約4 μL）為：DNA（5 ng·μL-1）2 μL，2×KASPar Mix 2 μL，KasPar引物預(yù)混液0.055 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，61 ℃（每個循環(huán)降低0.6 ℃）1 min，9個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃1 min，26個循環(huán)；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，9個循環(huán)。利用Roche 480Ⅱ熒光定量儀讀取PCR產(chǎn)物的熒光值，統(tǒng)計分型結(jié)果：分型結(jié)果與親本PBC932相同的記為“a”，與77013相同的記為“b”，雜合位點記為“h”，未識別的記為“_”，分析篩選出在親本間具多態(tài)性的KASPar引物。

1.6 多態(tài)性標(biāo)記分析群體及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

用親本間存在多態(tài)性的KASPar引物對BC4S1群體進行分析，統(tǒng)計引物在群體中的熒光分型結(jié)果。結(jié)合病斑數(shù)據(jù)和標(biāo)記分型數(shù)據(jù)，利用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，再結(jié)合MapQTL 6.0軟件分析綠熟期主效基因與分子標(biāo)記位點間的連鎖關(guān)系，兩個軟件中LOD最小閾值均選擇3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒炭疽病抗性遺傳分析

抗病親本PBC932及F1全部表現(xiàn)為抗病，77013全部表現(xiàn)為感病，抗病性表現(xiàn)為顯性遺傳。BC4S1群體共接種129個單株，其中21株表現(xiàn)為抗病，55株表現(xiàn)為中抗，53株表現(xiàn)為感?。籅C3S1群體共接種220個單株，其中55株表現(xiàn)為抗病，38株表現(xiàn)為中抗，69株表現(xiàn)為感病，其余58株因綠熟果數(shù)量不足未獲得數(shù)據(jù)，抗病與中抗單株均屬于抗炭疽病植株，兩個群體綠熟期抗感植株的分離比例均為9∶7（表1），兩個群體抗感單株卡方檢測的結(jié)果表明，辣椒綠熟期抗性至少受2對以上顯性基因控制。

表1 辣椒綠熟期尖孢炭疽菌抗性遺傳分析

2.2 辣椒綠熟期炭疽病抗性遺傳定位

在初定位的區(qū)段內(nèi)利用已有的SNP標(biāo)記共篩選了120個KASPar標(biāo)記。其中10個KASPar標(biāo)記（表2）在PBC932和77013兩個親本間存在多態(tài)性，多態(tài)性比例為12.20%。

利用10個多態(tài)性KASPar引物分析BC4S1群體的129個單株，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后，利用JoinMap 4.0軟件在LOD≥3、步長為0.5的前提下構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，再結(jié)合BC4S1群體的表型病斑數(shù)據(jù)，利用MapQTL 6.0軟件在加密的初定位區(qū)段內(nèi)對綠熟期主效基因AnRGO5進行進一步定位分析，發(fā)現(xiàn)綠熟期主效基因位于相距6.8 cM的UN27353_1781和UN32931_776兩個側(cè)翼SNP標(biāo)記之間，UN27353_1781標(biāo)記與AnRGO5基因遺傳連鎖距離為2 cM（圖1、2）。

2.3 辣椒綠熟期炭疽病抗性遺傳分子標(biāo)記的驗證及應(yīng)用

利用UN27353_1781標(biāo)記對BC3S1群體220個單株進行分子標(biāo)記驗證，BC3S1群體除了10株與表型鑒定結(jié)果不相符外，其他都與鑒定結(jié)果相一致。再用UN27353_1781標(biāo)記對BC4S2群體的124個單株進行抗病性分析，共有14個抗病純合單株；對篩選出的14個單株進行抗病性鑒定，除了1株不抗病外，其他13株都抗病，準(zhǔn)確率達(dá)到92.9%。驗證結(jié)果表明：UN27353_1781標(biāo)記的鑒定效率較高，可以進行快速鑒定，有效用于辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記輔助選擇育種。

表2 與辣椒綠熟期抗炭疽病主效基因緊密連鎖的KASPar標(biāo)記信息

圖1 KASPar引物（UN27353_1781）在BC4S1群體（129株）中的熒光分型結(jié)果

圖2 AnRGO5基因的遺傳連鎖圖譜

3 結(jié)論與討論

截至目前，與辣椒抗炭疽病相關(guān)QTL定位的報道較多（劉建萍 等，2006；Lin et al．，2007；馬榮群 等，2008；Mahasuk et al．，2009；Kim et al．，2010），Lin等（2007）研究辣椒材料0038-9155（由PBC932衍生）對尖孢炭疽菌的抗性遺傳，發(fā)現(xiàn)綠熟期的抗性由兩個互補的顯性基因共同控制，紅熟期的抗性由2個重疊的隱性基因控制，且這兩個時期的抗性基因是相互獨立的；Mahasuk等（2016）利用PBC932衍生群體進行了炭疽病抗性相關(guān)QTL研究，將綠熟期和紅熟期的兩個QTL都定位到了2號染色體的相同位點，位于CAP_T39318_0_1_1042和CAP_T22290_0_1_429兩個SNP標(biāo)記之間，而本試驗將綠熟期的主效基因定位在5號染色體末端，盡管選用的抗性材料都是PBC932，但病原菌種類和致病性不同，炭疽病病癥評價方法也不同，這些都會影響其產(chǎn)生不同的抗性機制。由此可見，辣椒炭疽病抗性受病原菌致病型（不同的誘導(dǎo)因子）、果實成熟期（不同的抗性基因）、接種方法（不同的防御機制）、抗性材料的不同而存在差異，其遺傳機制相對較為復(fù)雜（Lin et al．，2002；Pakdeevaraporn et al．，2005；Kim et al．，2007；Mahasuk et al．，2009；Yoon et al．，2009）。

目前已獲得的與炭疽病抗性緊密連鎖的標(biāo)記并不多，本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上找到1個與AnRGO5緊密連鎖的側(cè)翼KASPar分子標(biāo)記UN27353_1781，遺傳圖距為2 cM。由于KASPar標(biāo)記簡便、高效，具有很強的靈活性和實用性，為進一步篩選與抗炭疽病緊密連鎖的標(biāo)記創(chuàng)造了可能，同時也為下一步精細(xì)定位及克隆AnRGO5基因奠定了基礎(chǔ)。

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Mapping of Major QTLs Resistant to Anthracnose（Colletotrichum acutatum）in Pepper（Capsicum spp.）and Marker Development

LIU Yi-wei，ZHANG Zheng-hai，CAO Ya-cong，ZHAO Hong，WANG Li-hao，ZHANG Bao-xi*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

BC3S1and BC4S1populations containing 220 individuals and 129 individuals derived from crossing PBC932（Capsicum chinense）highly resistant to Anthracnose as male parent and susceptible 77013（Capsicum annuum）as female and recurrent parent were indentified with Colletotrichum acutatum resistance and analysized by SNP（KASPar）molecular marker．The results discovered that UN27353_1781 marker was closely linked to Anthracnose resistant AnRGO5 gene during green ripe stage．Their genetic distance was 2 cM．Marker UN27353_1781 was further verified in 124 individuals from BC4S2population. The selection accuracy reached 92.9%，indicating this marker could be effectively used in pepper marker-assisted breeding for Anthracnose resistance.

Capsicum；Anthracnose；Resistance；Colletotrichum acutatum；KASPar marker

劉議蔚，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：liuyiwei08@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：張寶璽，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhangbaoxi@caas.cn

2016-07-05；接受日期：2016-09-04

國家自然科學(xué)基金項目（31572121），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項目（CAAS-ASTZP-ZVFCAAS），農(nóng)業(yè)部大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-25）