激光微孔脫細胞豬真皮支架對Ⅲ度皮膚燒傷血管化的影響

盛小輝，朱寶昌，馮世海，劉　群，于維陸（.天津醫(yī)科大學研究生院，天津　00070；.天津市第四醫(yī)院燒傷科，天津　00；.天津市托福醫(yī)用原子能科技有限公司，天津　009）

?

激光微孔脫細胞豬真皮支架對Ⅲ度皮膚燒傷血管化的影響

盛小輝1，朱寶昌1，馮世海2，劉群2，于維陸3
（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津市第四醫(yī)院燒傷科，天津300222；3.天津市托福醫(yī)用原子能科技有限公司，天津300192）

摘要目的：探討新的脫細胞方法配合激光打孔制備的激光微孔脫細胞豬真皮支架對大鼠Ⅲ度皮膚燒傷創(chuàng)面血管化的影響。方法：將激光微孔脫細胞豬真皮(A組)、普通打孔脫細胞豬真皮（B組）兩種真皮支架分別移植至Ⅲ度皮膚燒傷清創(chuàng)后創(chuàng)面，另設無真皮支架對照創(chuàng)面（C組），1周后加植表皮。大體觀察植入真皮支架1、2、3周創(chuàng)面的修復情況，并通過HE染色和免疫組化標記創(chuàng)面中CD31、α-SMA表達陽性血管并計數(shù)。結果：制備的脫細胞豬真皮呈瓷白色，有光澤，柔軟；顯微鏡下未見細胞殘留。加植表皮后，A組較B組存活率高。兩組支架植入后及無支架對照組1～3周創(chuàng)面中CD31、α-SMA表達陽性血管數(shù)持續(xù)增加，其中兩組真皮支架均較無支架組多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；A組顯著高于B、C組（P<0.05）。結論：該方法制備的激光微孔脫細胞豬真皮基質能快速血管化，提高表皮存活率，為一種較理想的真皮替代物。

關鍵詞真皮替代物；脫細胞真皮，豬；微孔；皮膚移植；燒傷；大鼠

Effectoflasermicroporeporcineacellulardemalmatrixonvascularizationofwoundswithfull-thicknessburn

SHENG Xiao-hui1,ZHU Bao-chang1,FENG Shi-hai2,LIU Qun2,YU Wei-lu3
（1.Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Department of Burn,The Fourth Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China;3.Tianjin Toefl Medical Atomic Energy Technology Co.,Ltd,Tianjin 300192,China）

Abstract Objective:To explore the influence of the new method-laser micropore porcine acellular demal matrix in vascularization of wounds in rats with full-thickness burn.Methods：Laser micropore porcine acellular demal matrix(A group)and porcine acellular demal matrix(B group)were respectively transplanted on the rats with full-thickness burn after wound debridement,and there were no dermal in the control group(C group).Then skin was transplanted into the rats of the three groups one week later.The reparation of dermal implant wound was recorded after 1,2 and 3 weeks respectively.At the same time,CD31,α-SMA positive signals detected by immunohistochemical staining and HE staining were used to observe the effect of repairation.Results：The well-prepared laser microspore porcine acellular dermal matrix was characterized by its porcelain white color,softness and good elasticity.Histological examination revealed that laser microspore porcine acellular dermal matrix was totally devoid of epidermis and cellular components.Group A had higher survival rate than group B.From 1th to 3th week,the number of vessels with CD31 and α-SMA expression were continuously increased in the three groups.The number of vessels with CD31 and α-SMA expression in group A and B were significantly higher than in group C(P<0.05).The difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion：Laser microspore porcine acellular demal matrix can be used as an ideal dermal substitute due to its ability of initiating revascularization rapidly which may increase the survival rate of the grafted skin.

Key words dermal substitutes;acellular dermal matrix;microporous;skin transplantation;burns；rat

大面積燒傷患者創(chuàng)面多需要進行自體皮膚移植才能修復，但是由于患者的供皮區(qū)有限，用皮膚替代物覆蓋創(chuàng)面用以保護和促進創(chuàng)面的愈合已成為迫切需要。近年來，異種（豬）脫細胞真皮基質在臨床得到了廣泛地推廣應用[1]。目前表皮分離和去除真皮細胞成分的方法有酶消化法、化學去污劑、高滲鹽水法及戊二醛等法，物理的方法對支架結構的破壞較小但脫細胞效果較差，而化學方法脫細胞效果較好卻容易破壞細胞結構，且一些化學試劑的殘留可能導致一些不良反應,妨礙細胞生長，影響應用效果。我們在前人脫細胞方法的基礎上進行改進，并配合激光打孔技術制備的激光微孔脫細胞豬真皮，移植入大鼠Ⅲ度燒傷模型，觀察血管化過程及組織學改變，為臨床提供理論和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物72只質量300g左右雄性無病原體級SD大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）。

1.1.2主要儀器及實驗材料恒溫振蕩器(上海醫(yī)療器械廠)；-80℃冰箱（安徽中科都菱）；0.5%戊二醛水溶液；胰蛋白酶（美國Sigma公司），0.1%新潔爾滅；二氧化碳激光加工機（天津物理激光研究所）。脫細胞（豬）真皮，制作方法見下。試劑：CD31單克隆抗體（美國Abbiotec公司），α-SMA單克隆抗體（英國Abcam公司），生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶（SP）免疫組織化學檢測試劑盒（美國Zymed公司）。

1.1.3激光微孔脫細胞真皮的制作新鮮無疫豬皮8塊（天津市托福醫(yī)用原子能科技有限公司提供），每塊約10 cm×20 cm，洗凈、剃毛，置于體積分數(shù)0．1%新潔爾滅溶液內浸泡15 min。在無菌條件下用取皮鼓切取厚度0．4 mm的斷層皮片，將獲得的斷層真皮片即真皮基質隨機分成兩部分，一部分打孔：采用懸空法激光打孔技術，打孔時真皮基質不直接接觸臺面，以l mm為孔間隙，在懸空固定的真皮基質材料上行均勻貫穿性打孔，從而獲得一種新型激光微孔化真皮基質；一部分斷層真皮基質不打孔。兩組皮片在含青霉素、鏈霉素各1 g/L的等滲鹽水中浸泡1 h。將斷層皮片浸入0.4 g/L胰蛋白酶溶液中20℃消化2 h。無菌條件下揭去表皮，將真皮在磷酸鹽緩沖液（PBS）中持續(xù)振蕩洗滌，去除已分離的細胞；再用同樣濃度的胰蛋白酶37℃下消化1 h，PBS洗滌后取標本行組織學觀察。將皮片分別置于4℃預冷、-70℃冷凍2 h、37℃下融化，如此反復凍融3次，PBS充分洗滌后，置入含青霉素、鏈霉素各1 g/L的PBS中浸泡2 h，再用PBS洗滌2次，將其置于無菌培養(yǎng)瓶中，封口，60Co照射殺菌，-18℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆茫▋鋈诿摷毎す馕⒖桩惙N真皮基質制備方法及其產品專利號：ZL201110150545.7）。

1.2方法

1.2.1動物模型的制作及實驗方法SD大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，俯臥位固定，背部脫毛，在背部制備1個3 cm×3 cmⅢ度皮膚燒傷創(chuàng)面[2]，常規(guī)清創(chuàng)后用碘伏紗布包扎，每日換藥1次。傷后48 h內行創(chuàng)面切痂，切痂直徑為(3.10± 0.05)cm，切痂徹底止血后將真皮基質縫合于創(chuàng)面，留長線打包備用。72只大鼠根據(jù)創(chuàng)面覆蓋物的不同分為以下3組，每組24只：A組予以激光微孔脫細胞（豬）真皮、B組予以普通打孔脫細胞（豬）真皮、C組暫以油紗覆蓋。于真皮覆蓋1周后揭開油紗，觀察各組大鼠創(chuàng)面大體情況，并加植表皮，取創(chuàng)面組織固定、包埋。加植表皮方法：避開燒傷創(chuàng)面剔毛后切取背部全層皮膚，剪成0.6 cm×0.6 cm大小置于4 g/L胰蛋白酶4℃消化過夜后鑷子分離獲得表皮，于支架或者油紗覆蓋后1、2周打開敷料，將表皮植入3組創(chuàng)面上，加壓固定。

1.2.2創(chuàng)面及對照創(chuàng)面的取材A、B、C 3組均在支架移植術后1、2、3周時，每組取8只大鼠的創(chuàng)面打開內層敷料，觀察創(chuàng)面，在創(chuàng)面中間切取1 cm×0．5 cm深至肌層的組織塊。同樣對1、2、3周時對照組創(chuàng)面進行觀察和取材。HE染色后進行組織學觀察。

1.2.3創(chuàng)面免疫組織化學檢測按SP免疫組化試劑盒說明書檢測CD31、α-SMA表達情況。CD31、α-SMA一抗稀釋濃度分別為1∶100和1∶50，實驗陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。CD31陽性信號為紅色，主要由血管內皮細胞表達，鏡下著紅色的單個或相鄰2個細胞以及環(huán)狀物均視為1條陽性血管；α-SMA陽性信號為棕色或黃色，主要在血管中層表達，鏡下每個黃色或棕色環(huán)狀物視為1條陽性血管，黃色或棕色點狀物可能為肌成纖維細胞不計入內。不同時間點實驗和對照組，每例組織切片于400倍光鏡下隨機觀察10個視野的陽性信號計數(shù)，取平均值作為單個樣本檢測值。

2　結果

2.1脫細胞豬真皮支架性狀實驗制備的脫細胞豬真皮支架呈瓷白色，有光澤，柔軟，彈性和韌性佳，剪切方便，未見明顯皺縮。組織學檢測無表皮，真皮內無任何細胞成分、皮膚附件及血管，膠原結構完整，未見斷裂（圖1）。

圖1　脫細胞豬真皮膠原結構完整，無斷裂（A.HE×100，B.HE×400）Fig 1 Porcine acellular dermal collagen was intact and without fractrue（A.HE×100，B.HE×400)

2.2創(chuàng)面基本情況及切片組織學觀察

2.2.1 A組：術后1周大體觀察真皮基質紅潤，創(chuàng)面無分泌物，與基底部結合緊密；組織學觀察顯示：真皮基質與基底創(chuàng)面未完全結合，自基底長出新生組織，支架與創(chuàng)面結合部位可見少量炎性細胞浸潤，微孔周圍的膠原有較多的成纖維細胞，內含多個紅細胞征象，創(chuàng)面內可見新生血管形成。術后第2周：A組創(chuàng)面皮片融合，皮片生長情況好；組織學觀察顯示:支架與創(chuàng)面完全結合，支架內全層可見大量炎性細胞浸潤，但表面無明顯血管形成的支架層仍較厚，創(chuàng)面內可見較多的新生血管。術后3周：A組皮片融合成片，皮片生長情況好，支架已與創(chuàng)面完全結合，但仍可見其分界，支架表層可見血管形成，創(chuàng)面內可見較多垂直于創(chuàng)面生長血管。

2.2.2 B組：術后1周真皮基質紅潤，無分泌物；組織學顯示真皮基質與基底創(chuàng)面未完全結合，支架與創(chuàng)面結合部位可見少量炎性細胞浸潤，創(chuàng)面內新生血管形成較A組少。術后2周，少量表皮皮片存活，取標本見基底部結合松散易揭下并見少許分泌物，組織學觀察顯示支架與創(chuàng)面基底結合松散。術后3周皮片發(fā)黑壞死，有較多的分泌物。

2．2.3 C組：術后1周可見肉芽組織生長；術后2周皮片存活，凹陷不平坦；術后3周皮片有瘢痕形成。

2.3同支架植入創(chuàng)面及對照創(chuàng)面CD31、α-SMA免疫組化實驗結果移植后1～3周，A、B組創(chuàng)面CD31、α-SMA表達陽性的血管數(shù)均明顯多于C組，A組明顯多于B組，B組明顯多于C組；各組不同觀察時間點2周均明顯多于1周，3周明顯多于2周，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表l、2，圖2～5。

圖2　激光微孔脫細胞豬真皮植入3周后CD31表達（IHC×100）Fig 2 Positive signals(red)of CD31expressedinwoundin3weeks afterthe lasermicrosporeporcineacellulardermalmatrix （IHC×100）

圖3　普通打孔脫細胞豬真皮植入3周后CD31表達（IHC×100）Fig 3 Positive signals(red)of CD31 expressed in wound in 3 weeks after the porcine acellular dermal matrix(IHC×100)

圖4　激光微孔脫細胞豬真皮植入3周后α-SMA表達（IHC×100）Fig4 Positivesignals(brown)of CD31expressedinwoundin3weeks after the laser microspore porcine acellular dermal matrix （IHC×100）

圖5　普通打孔脫細胞豬真皮植入3周后α-SMA表達（IHC×100）Fig 5 Positivesignals(brown)of CD31expressedinwoundin3weeks after the porcine acellular dermal matrix（IHC×100）

表1　各組創(chuàng)面CD31陽性血管數(shù)比較（條）Tab 1 Comparison of CD31 positive blood vessels in each group

表2　各組創(chuàng)面α-SMA陽性血管數(shù)比較（條）Tab 2 Comparison of α-SMA positive blood vessels in each group

3　討論

皮膚移植是救治大面積燒傷、創(chuàng)傷和后期整形的重要措施，對于大面積深度燒傷創(chuàng)面而言,切削痂后采用大張異體皮加微粒自體皮(或嵌入小塊自體皮)覆蓋可使創(chuàng)面盡早封閉。然而異體皮來源困難且價格昂貴,又有傳播疾病的可能性[3]。尋找一種理想的皮膚替代物一直是臨床上一個亟待解決的難題。國內外在真皮替代物方面開展了大量研究，并且已生產出人工真皮，如Integra、Dermagraft和Apligraf等[4]成品，這些皮膚替代物在臨床上的應用取得了一定的效果，但是其價格昂貴，限制了其應用。由于豬皮膚與人類有著相似的結構，特別是兩者真皮基質膠原成分和含量相似，而且來源廣泛、成本低廉，因此豬脫細胞真皮基質可成為人類真皮缺損的理想替代物。近幾年來異種脫細胞（豬）真皮基質在臨床得到了推廣應用[5-6]。

目前脫細胞真皮基質的制備方法較多，無論何種方法，最佳的處理應該是能夠達到去除真皮內所有的細胞成分而最大限度保留真皮內膠原結構等的完整性。我們在總結傳統(tǒng)脫細胞方法的優(yōu)缺點及先期的研究基礎上進行了創(chuàng)新性研究，在脫細胞之前先采用激光打微孔，其優(yōu)點是減少了熱量作用于真皮組織所致的損傷；將打孔后的中厚皮反復凍融3次，配合胰蛋白酶進一步消化殘存的細胞，可減少反復凍融的次數(shù),超聲振蕩可脫去已被破壞、死亡細胞及細胞碎片；本制備方法減輕了其他方法對真皮結構的損傷，能脫去有抗原性的細胞成分，保留異種皮中膠原的完整性。梁黎明等[7]在豬脫細胞真皮基質的加工過程中引入激光打孔技術，在真皮基質上制作出均勻密布的微孔，以利于組織間液滲透和微血管再生，從而提高復合皮移植成活率，改善創(chuàng)面愈合質量。其研究對孔間距做了專門探討，認為孔間距為1.0 mm的激光微孔脫細胞（豬）真皮與自體刃厚皮復合移植效果最佳。

血管化速度是影響組織工程皮膚的主要因素[8]，決定了表皮移植的成功率和成活速度[9]。新生組織中的血管，可以為膠原網架中遷入的成纖維細胞提供足夠的氧氣等營養(yǎng)物質，從而為真皮的修復和重建提供良好的微環(huán)境[10]。CD31是一種跨膜蛋白，為血管內皮細胞的特異性表面標志[11]，常用于評價新生血管。如血管成熟，血管內皮細胞周圍會有平滑肌細胞環(huán)繞，α-SMA能特異性標記平滑肌細胞[12]，因此可用來判斷新生血管成熟度，且為成熟血管的一種標志。本實驗采用CD31和α-SMA免疫組化染色法觀察創(chuàng)面血管化情況。結果表明，不同脫細胞（豬）真皮支架組和油紗對照組處理后1～3周，創(chuàng)面新生血管和成熟血管均持續(xù)增多，其中以激光微孔脫細胞（豬）真皮組最多、普通打孔脫細胞（豬）真皮組次之、油紗對照組最少。由此可見2種脫細胞（豬）真皮支架均可誘導新生血管的產生及其成熟，以激光微孔脫細胞（豬）真皮支架效果尤為明顯。創(chuàng)面大體觀察和HE染色結果也支持這一結論。支架內新生血管不能及時到達支架的表層，可使支架表面移植的表皮不能成活，同時也說明支架表面移植表皮的成活依賴于支架的血管化水平[13]。

綜上所述，本研究研制的激光微孔脫細胞（豬）真皮基質能快速血管化和促進表皮成活，提高復合皮移植成功率，可較好較快地修復皮膚Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，其在燒傷皮膚移植及組織工程皮膚構建中有良好應用前景。

參考文獻：

[1]柴家科，楊紅明，李利根，等.去細胞異體真皮、去細胞豬真皮和自體刃厚皮移植在臨床中的應用[J].中華外科雜志,2000,38（10）:790

[2]吳志谷，耿淼，付小兵，等．小面積標準燙傷儀的實驗應用[J]．中國臨床康復，2002,6（20）:3033

[3]陳曉東，施彥，楊榮華，等.異種(豬)脫細胞真皮基質對大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-8、白細胞介素-1表達的影響[J].中華損傷與修復雜志（電子版）,2014，9（2）:137

[4]Boyce S T．Design principles for composition and pedormance of cultured skin substitutes[J]．Bums，2001,27（5）：523

[5]周牮，李影學，遲云飛，等.早期應用異種脫細胞真皮基質修復小兒Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的療效觀察[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2015,9 （8）:1472

[6]寧勇，劉明鎖，劉文文，等.異種脫細胞真皮基質覆蓋自體微粒皮治療大面積深度燒傷療效觀察[J].山東醫(yī)藥,2014,54（44）:91

[7]梁黎明，柴家科，楊紅明，等.激光微孔豬脫細胞真皮基質制備及創(chuàng)面移植的觀察[J].中華燒傷雜志,2007,23（2）:122

[8]Metcalfe A D，F(xiàn)ergnson M W．Harnessing wound healing and regeneration for tissue engineering[J]．Biochem Soc Trans,2005,33 （Pt 2）:413

[9]Wang Y,Mithieux S M,Kong Y，et a1.Tropoelastin incorporation into a dermal regeneration template promotes wound angiogenesis[J].Adv Healthc Mater,2015,4（4）:577

[10]辛國華，曾逃，方羅旭，等.微孔結構對脫細胞真皮基質膠原網架功能重建的影響[J].廣東醫(yī)學，2012，33（3）:310

[11]Valarmathi M T,Davis J M,Yost M J,et a1.A three-dimensional model of vasculogenesis[J]．Biomaterials，2009,30（6）:1098

[12]Nillesen S T,Geujes P J,Wismans R,et a1.Increased angiogenesis and blood vessel maturation in acellular collagen-heparin scarfolds containingboth FGF2and VEGF[J].Biomatefials,2007,28（6）:1123

[13]徐少駿，馬列，滕建英，等.不同材料人工真皮支架修復豬Ⅲ度燒傷創(chuàng)面比較[J].中華整形外科雜志，2010，26（5）：360

（2015－07－30收稿）

作者簡介盛小輝（1986-），男，碩士在讀，研究方向：吸入性損傷、重癥燒傷、燒傷后整形；通信作者：劉群，E- mail：zbcgzyx@163.com。

文章編號1006－8147（2016）01-0017-04

中圖分類號R644

文獻標志碼A