李敬杰，劉金輝，王海寬（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

雙酶梭菌TK6的篩選及益生物質(zhì)對(duì)其代謝活力的影響

李敬杰，劉金輝，王海寬
（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

本實(shí)驗(yàn)采用傾注法從健康成年人的糞便中篩選雙酶梭菌（Clostridium bifermentans）TK6，該菌有益于反芻動(dòng)物，其發(fā)酵產(chǎn)物有消化酶、短鏈脂肪酸以及α-酮異己酸（KIC）等益生物質(zhì).分別利用7種低聚糖（低聚葡萄糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、棉籽糖以及水蘇糖）為唯一碳源進(jìn)行TK6的對(duì)比發(fā)酵，測定其不同發(fā)酵液中短鏈脂肪酸、異丁酸、α-酮異己酸、消化酶等益生物質(zhì)的含量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同低聚糖作為唯一碳源對(duì)TK6的生長促進(jìn)程度不同，并對(duì)其產(chǎn)生的水解酶、短鏈脂肪酸等物質(zhì)有不同的影響.菌株TK6利用低聚異麥芽糖為唯一碳源時(shí)，其活菌數(shù)最大，為（7.97±0.16）×108，mL-1；并且其產(chǎn)乙酸、丁酸的促進(jìn)作用最大，分別為（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L；產(chǎn)纖維素酶活力最高，達(dá)到（1，994.84±254.52）U/mL.菌株利用低聚木聚糖為唯一碳源時(shí)，其發(fā)酵液產(chǎn)木聚糖酶的酶活力最高，為（135.86±1.82）U/mL；利用低聚果糖為唯一碳源時(shí)，其發(fā)酵液蛋白酶活力最高，為（10.12±4.34）U/mL.當(dāng)添加150，mmol/L的L-亮氨酸，37，℃孵化4，h時(shí)，KIC產(chǎn)量最高為（8.18±0.06）mg/L.

雙酶梭菌；功能性低聚糖；短鏈脂肪酸（SCFA）；水解酶

反芻動(dòng)物經(jīng)過長期進(jìn)化形成了依靠瘤胃微生物的發(fā)酵作用降解、利用飼料的消化系統(tǒng).有報(bào)道指出瘤胃微生物對(duì)反芻動(dòng)物機(jī)體的蛋白質(zhì)和糖類代謝、維生素合成消化、降解低聚糖以及發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸提供能量等都有相當(dāng)重要的作用［1］.用芽胞桿菌菌制劑飼喂奶牛，可改善牛乳的質(zhì)量，并可顯著增加產(chǎn)奶量；飼喂?fàn)倥?，可顯著增加犢牛的日增重，以及提高對(duì)犢牛的大腸桿菌性下痢的治愈率；飼喂綿羊，可增加綿羊?qū)w維素的利用率［1-3］.雙酶梭菌代謝產(chǎn)物范圍很廣，包括各種有機(jī)分子等碳水化合物、有機(jī)酸、醇類、芳香族化合物、氨基酸、胺類、嘌呤和嘧啶［4］.雙酶梭菌是嗜溫細(xì)菌，嚴(yán)格厭氧，革蘭氏陽性，產(chǎn)芽胞，芽胞卵圓，中到次端生，有一個(gè)厚的芽胞壁，發(fā)酵產(chǎn)丁酸、異丁酸與消化酶，耐酸堿、高溫，耐受飼料的加工儲(chǔ)藏與胃的酸性環(huán)境等，在腸道內(nèi)可萌發(fā)為有新陳代謝作用的益生細(xì)胞，其發(fā)酵液中含有較高活性的消化酶，對(duì)植物碳水化合物有較強(qiáng)的降解能力，并能提高飼料轉(zhuǎn)化率，是優(yōu)良的益生菌候選者［5］.因此，雙酶梭菌替代抗生素添加到反芻動(dòng)物的飼料中，是本實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)方向.益生菌、有機(jī)酸、酶制劑等微生態(tài)制劑調(diào)控反芻動(dòng)物的營養(yǎng)代謝途徑，并對(duì)改善瘤胃發(fā)酵、促進(jìn)動(dòng)物生長、提高免疫力有一定功效，是潛在的抗生素替代產(chǎn)品［6-7］.

本文從健康成年人的糞便中篩選高產(chǎn)酶與短鏈脂肪酸（SCFA）益于反芻動(dòng)物的雙酶梭菌，測定雙酶梭菌利用7種低聚糖發(fā)酵結(jié)果，并對(duì)產(chǎn)生的各種益生物質(zhì)進(jìn)行測定，旨在為雙酶梭菌合生元的開發(fā)以及反芻動(dòng)物的候選益生菌提供了理論基礎(chǔ)與應(yīng)用依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

取天津本地的23～30歲健康成年人的新鮮糞便約10，g，溶于90，mL滅菌后的生理鹽水中，稀釋均勻.

1.1.2 培養(yǎng)基

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（g/L）［8］：葡萄糖5.0，蛋白胨20.0，瓊脂10.0，pH 7.4.

BHI培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛心浸粉17.5，NaCl 5.0，葡萄糖2.0，K2HPO4·12H2O 2.5，pH 7.4，121，℃滅菌20，min.

RCM培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，NaCl 5.0，醋酸鈉3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂0.5，pH 6.8，121，℃滅菌20，min.

低聚葡萄糖（glucoseoligosaccharides，GLOS）培養(yǎng)基（g/L）：低聚葡萄糖5，蛋白胨10，K2HPO45，MgSO40.2，MnSO40.2，pH 7.4，115，℃滅菌20，min.

分別用低聚半乳糖（galatooligosaccharides， GOS）、低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharides，IMOS）、低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）、低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）、水蘇糖及棉籽糖替代種子培養(yǎng)基中的低聚葡萄糖（GLOS）作為唯一碳源，其他成分不變.實(shí)驗(yàn)用功能性低聚糖的組成與結(jié)構(gòu)見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)用功能性低聚糖組成與結(jié)構(gòu)Tab. 1Composition and structure of functional oligosaccharides

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 傾注法篩選

用滅菌吸量管吸取樣品1，mL，注入含有9，mL生理鹽水的試管中，另換1支1，mL滅菌吸量管反復(fù)吹吸數(shù)次，此液為1﹕10稀釋液。按上述操作順序做10倍遞增稀釋液。吸取10-5、10-6、10-7這3個(gè)梯度稀釋液于已滅菌的平板中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平板，然后將冷卻至50，℃左右的RCM固體培養(yǎng)基注入平板中，并轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之與樣液混勻，待培養(yǎng)基凝固后，37，℃厭氧培養(yǎng)（H2、CO2與N2的體積比為1﹕1﹕8）12，h.反復(fù)兩次挑取單菌落，直至平板上只含有大小形態(tài)都相同的單一菌落.挑取單菌落于10，mL的BHI液體培養(yǎng)基試管中，37，℃厭氧培養(yǎng)（H2、CO2與N2的體積比為1﹕1﹕8）19，h，1﹕1保存于60%，的甘油管中，-70，℃冰箱保存.

1.2.2 提取基因組，PCR擴(kuò)增16S，rDNA測序

采用酚氯仿抽提法提取分離菌株的基因組，菌株TK6通過16S rDNA方法鑒定。篩選分離出的菌株由北京六合華大基因技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA測序.使用NCBI BLAST軟件在DDBJ/EMBL/Gen-Bank中使用參考菌株同源性進(jìn)行搜索.

1.2.3 活菌計(jì)數(shù)

取1，mL樣品用9，mL的無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，取1，mL適當(dāng)?shù)南♂屘荻扔谘b有9，mL的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的厭氧管內(nèi)，37，℃厭氧培養(yǎng)36，h［8］.

1.2.4 發(fā)酵上清液的制備

從甘油管中接0.1%，的菌體于10，mL BHI液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)19，h后，振蕩混勻，取2，mL菌液于裝有40，mL不同功能性低聚糖的液體培養(yǎng)基的50，mL的圓底燒瓶中，厭氧培養(yǎng)32，h.取5，mL的液體于5，mL的EP管中，12，000，r/min離心10，min，取上清液，即為發(fā)酵液.

1.3 菌株TK6的發(fā)酵產(chǎn)物測定

1.3.1 消化酶活性的測定

采用GB/T 23527—2009，F(xiàn)olin試劑顯色法測蛋白酶活性［9］，采用CMC-糖化力法測定纖維素酶活性［10-11］，參考王振華［1］的方法測定木聚糖酶活性.

1.3.2 短鏈脂肪酸（SCFA）濃度的測定

參考Wang等［8］的方法進(jìn)行發(fā)酵樣品處理，SCFA標(biāo)準(zhǔn)品混合物包括乙酸、丁酸、異丁酸，采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品中SCFA濃度［12］.

1.3.3 α-酮異己酸（KIC）含量的測定

雙酶梭菌于10，mL BHI液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)19，h后，取2，mL菌液轉(zhuǎn)接于40，mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中（做5組對(duì)照），37，℃厭氧培養(yǎng)24，h.在超凈臺(tái)中分別向5個(gè)圓底燒瓶中加入不同濃度的前體物L(fēng)-亮氨酸（25、50、75、100、150，mmol/L），厭氧培養(yǎng)1、2、3、4、5，h后，分別取1，mL，離心取上清液，過膜處理.利用紫外高效液相色譜法測定KIC含量［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶梭菌的分離鑒定

實(shí)驗(yàn)通過傾注法分離培養(yǎng)后分離出11 株單菌落.根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［14］，雙酶梭菌為革蘭氏陽性（G+）菌，嚴(yán)格厭氧，菌體直或微彎，產(chǎn)芽胞，芽胞卵圓，偏心到次端生，菌株 B2、B6、C7、TK6符合要求.將得到的 4組序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行16S rDNA 序列同源性比對(duì)，B2、B6、C7、TK6與雙酶梭菌（C. bifermentans）的同源性分別達(dá)98%、99%、98%、100%，均屬于梭菌屬雙酶梭菌種.由于菌株TK6同源性達(dá)到100%，且等同條件下生長最旺盛，因此本文選定TK6進(jìn)行深入研究.

2.2 雙酶梭菌TK6體外發(fā)酵

2.2.1 不同功能性低聚糖對(duì)雙酶梭菌TK6菌體濃度的影響

功能性低聚糖不同的單體組成和結(jié)構(gòu)影響其在腸道的發(fā)酵與SCFA的合成［15］，雙酶梭菌TK6對(duì)不同功能性低聚糖的微生物利用率可以通過發(fā)酵結(jié)束獲得的菌體濃度來判斷，結(jié)果見表2.

表2 不同功能性低聚糖對(duì)雙酶梭菌TK6菌體濃度的影響Tab. 2Effect of different functional oligosaccharides on the growth of C. bifermentans TK6

不同的低聚糖結(jié)構(gòu)顯著影響雙酶梭菌TK6的發(fā)酵效果，實(shí)驗(yàn)中7種功能性低聚糖都能被雙酶梭菌TK6不同程度利用，`其中，IMOS與GOS表現(xiàn)出對(duì)益生菌雙酶梭菌TK6顯著的促生長益生功能。雙酶梭菌TK6發(fā)酵IMOS獲得的菌體濃度最高，達(dá)到（7.97±0.16）×108，mL-1，利用GOS獲得的菌體濃度高于棉籽糖和水蘇糖，而對(duì)FOS以及XOS的利用率不高.

2.3 雙酶梭菌TK6體外發(fā)酵水解酶活性

分別利用7種低聚糖為碳源發(fā)酵后，測定纖維素酶活力，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，菌株利用IMOS時(shí)，其發(fā)酵液產(chǎn)纖維素酶活力最高，達(dá)到（1，994.84±254.52）U/mL，其次是GOS與XOS，產(chǎn)量分別達(dá)到（1，536.69±203.62）U/mL與（811.30± 139.98）U/mL，可能是IMOS、GOS與XOS都有α-1，4糖苷鍵.分別利用7種低聚糖為碳源發(fā)酵后，測定纖維素酶活力，結(jié)果如圖2所示，菌株利用XOS發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的酶活力最高，為（135.86± 1.82）U/mL。木聚糖的單體主要為木糖，木聚糖酶水解以木糖為底物.分別利用7種低聚糖為碳源發(fā)酵后，測定蛋白酶酶活力，結(jié)果如圖3所示，利用FOS發(fā)酵時(shí)，蛋白酶酶活力最高為（10.12±4.34）U/mL.

圖1 利用7種低聚糖測定纖維素酶活力Fig. 1Cellulase activity using seven functional oligosaccharides

圖2 利用7種低聚糖測定木聚糖酶活力Fig. 2 Xylanase activity using seven functional oligosaccharides

圖3 利用7種低聚糖測定蛋白酶活力Fig. 3 Protease activity using seven functional oligosaccharides

由圖1—圖3可知，雙酶梭菌同時(shí)具有蛋白酶、纖維素酶與木聚糖酶的活性，楊勝坤等［7］報(bào)道雙酶梭菌制劑飼喂家兔，促進(jìn)家兔的生長與腸道消化酶活性的增強(qiáng)，提高飼料的利用率.王振華［1］認(rèn)為芽胞桿菌制劑提高反芻動(dòng)物消化酶活性是微生態(tài)制劑促進(jìn)反芻動(dòng)物生長作用的一個(gè)重要因素.雙酶梭菌TK6厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的水解酶可以降解飼料中的植物粗纖維、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、淀粉、可溶性糖及纖維素，改善其吸收方式，提高飼料營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化率，獲得生長、繁殖所需能量和各種營養(yǎng)物質(zhì)，間接固定粗纖維的能量，促進(jìn)反芻動(dòng)物生長［16］.雙酶梭菌TK6有望作為良好的益菌制劑添加到反芻動(dòng)物的飼料中. 2.4 雙酶梭菌TK6體外發(fā)酵不同功能性低聚糖產(chǎn)短鏈脂肪酸的特點(diǎn)雙酶梭菌TK6發(fā)酵不同種類的功能性低聚糖短鏈脂肪酸終產(chǎn)物主要是乙酸和丁酸（圖4），并以乙酸為主.功能性低聚糖的不同種類對(duì)異丁酸的產(chǎn)量影響不顯著，相比于對(duì)照組及其他功能性低聚糖，雙酶梭菌TK6對(duì)IMOS的發(fā)酵產(chǎn)生相對(duì)最高的乙酸和丁酸，分別達(dá)到（65.70±0.37）、（53.51±0.52）mmol/L；其次是GOS與水蘇糖，其乙酸與丁酸產(chǎn)量均較高，乙酸產(chǎn)量分別為（58.53±0.81）、（49.06±0.43）mmol/L，丁酸產(chǎn)量分別為（42.90±0.47）、（34.36± 0.10）mmol/L；對(duì)GLOS、XOS與FOS的利用率較低.數(shù)據(jù)顯示，丁酸梭菌TK2發(fā)酵不同功能性低聚糖代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸量與菌體濃度成正相關(guān)［8］，同時(shí)，再一次證明了雙酶梭菌TK6對(duì)XOS與FOS兩種功能性低聚糖的利用率不高.

圖4 雙酶梭菌TK6利用功能性低聚糖產(chǎn)乙酸、丁酸、異丁酸Fig. 4C. bifermentans TK6，using functional oligosaccharide production acetate，butyrate and isobutyrate

雙酶梭菌利用7種低聚糖發(fā)酵產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，產(chǎn)生的乙酸含量最高.Prohaszka等［17］報(bào)道乙酸能提高奶牛的泌乳量，特別是顯著提高乳脂率.反芻動(dòng)物從消化道中吸收的碳水化合物主要是SCFA，SCFA約占反芻動(dòng)物吸收能量的70%～80%，而乙酸是產(chǎn)量最大的SCFA.王振華［1］報(bào)道有機(jī)酸使腸道中的pH、EH值維持在較低的水平，有利于菌體攝取更多的營養(yǎng)促進(jìn)生長，同時(shí)可激活酸性蛋白酶的活性，促進(jìn)礦物質(zhì)磷、鐵、鈣及維生素D的吸收，提高飼料利用率.張振威等［18］報(bào)道西門塔爾牛日糧中添加異丁酸后，有機(jī)物、粗蛋白的消化率以及日增重顯著高于對(duì)照組，肉牛干物質(zhì)采食量顯著低于對(duì)照組，日糧添加異丁酸后對(duì)西門塔爾牛增重性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化和降低甲烷排放等都有顯著促進(jìn)作用.

2.5 雙酶梭菌TK6產(chǎn)KIC的特性

雙酶梭菌產(chǎn)KIC的產(chǎn)量與底物L(fēng)-亮氨酸、孵化時(shí)間有關(guān)（圖5）.當(dāng)添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h時(shí)，雙酶梭菌產(chǎn)KIC的產(chǎn)量最高為（8.18±0.06）mg/L.在動(dòng)物生產(chǎn)中添加KIC增加蛋白質(zhì)含量并促進(jìn)家畜生長.Flakoll等［19］用瘤胃保護(hù)性α-酮異己酸鈣鹽飼喂閹牛和羔羊，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物日增量增多，提高了飼料轉(zhuǎn)化率.Kuhlman等［20］研究發(fā)現(xiàn)瘤胃保護(hù)性KIC的添加可增強(qiáng)羔羊淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)以及抗豬紅細(xì)胞抗體反應(yīng).Nissen［21］還發(fā)現(xiàn)KIC對(duì)家畜乳脂的分泌具有促進(jìn)作用.

圖5 雙酶梭菌TK6產(chǎn)KICFig. 5 Production of KIC using C. bifermentans TK6

3 結(jié) 論

雙酶梭菌TK6發(fā)酵不同功能性低聚糖，短鏈脂肪酸終產(chǎn)物主要是乙酸和丁酸，功能性低聚糖的種類對(duì)異丁酸的產(chǎn)量影響不顯著，相比于其他功能性低聚糖，TK6發(fā)酵IMOS產(chǎn)生相對(duì)最高的乙酸和丁酸，分別為（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L.當(dāng)添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h時(shí)，TK6產(chǎn)KIC量最高為（8.18±0.06）mg/L.菌株TK6分別利用IMOS、XOS、FOS時(shí)，其發(fā)酵液中纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶活力達(dá)到最高，為（1，994.84± 254.52）、（135.86±1.82）、（10.12±4.34）U/mL.雙酶梭菌TK6耐酸堿、耐高溫、耐受飼料的加工儲(chǔ)藏與胃的酸性環(huán)境等，在腸道內(nèi)可萌發(fā)為有新陳代謝作用的益生細(xì)胞，其發(fā)酵液中含有較高活性的蛋白酶、纖維素酶，對(duì)植物碳水化合物有較強(qiáng)的降解能力，并能提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低反芻動(dòng)物的致病率，為工業(yè)化生產(chǎn)降低成本.雙酶梭菌可以作為反芻動(dòng)物的候選益生菌，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有必要進(jìn)一步驗(yàn)證.

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責(zé)任編輯：郎婧

Screening Clostridium bifermentans Strain TK6 and the Effect of Prebiotics on its Metabolic Activity

LI Jingjie，LIU Jinhui，WANG Haikuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Clostridium bifermentans TK6（C.bifermentans TK6）is a prebiotic of ruminant，whose fermentation products contain digestive enzyme，short chain fatty acid（SCFA）and α-ketoisocaproate（KIC）.It was screened from feces of healthy adults with the overlay method.Seven functional oligosaccharides，glucoseoligosaccharides（GLOS），fructooligosaccharides（FOS），galactooligosaccharides（GOS），xylooligosaccharides（XOS），isomaltoolig-osaccharides（IMOS），raffinose and stachyose，as the sole carbon source，were fermented respectively by C.bifermentans TK6 and contrasted. And then，the prebiotic content of each fermention product including SCFA，isobutyrate，KIC and hydrolase was checked.The results showed that each type of oligosaccharides as a sole carbon source has different effects on the growth of TK6 and the yield of hydrolase and SCFA.There is a significant increase of TK6 in IMOS，and the viable count is（7.97±0.16）×108mL-1.The production of acetate and butyrate reached（65.70±0.37）mmol/L and （53.51±0.52）mmol/L，respectively.Moreover，the cellulase activity reached（1，994.84±254.52）U/mL.Fermentation of XOS by TK6 resulted in the highest xylanase activity（135.86±1.82）U/mL，and the highest protease activity using FOS was（10.12±4.34）U/mL.The highest production of KIC was（8.18±0.06）mg/L while adding 150 mmol/L L-leucine and hatched 4 h at 37 ℃.

Clostridium bifermentans；functional oligosaccharides；short chain fatty acids（SCFA）；hydrolases

Q93

A

1672-6510（2016）03-0031-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150100

2015-08-05；

2015-12-31

李敬杰（1990—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：王海寬，教授，hkwang@tust.edu.cn.