張冬冬 ，季慕寅，徐　迪 ，張海燕，蕭　晟，楊艷麗

( 1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院　生物工程學(xué)院，安徽　蕪湖　241003；

2.蕪湖市畜牧獸醫(yī)局，安徽　蕪湖　241000 )

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蕪湖市規(guī)模雞場(chǎng)禽流感抗體水平的監(jiān)測(cè)與分析

張冬冬1，季慕寅1，徐迪1，張海燕1，蕭晟1，楊艷麗2

( 1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖241003；

2.蕪湖市畜牧獸醫(yī)局，安徽蕪湖241000 )

摘要：目的：免疫接種是預(yù)防禽流感疫情的最主要措施，通過(guò)抗體檢測(cè)判斷免疫效果并指導(dǎo)后續(xù)免疫措施的改進(jìn)，為蕪湖市禽流感的綜合防控提供了基礎(chǔ)依據(jù)；方法：2013年～2015年期間對(duì)蕪湖市部分規(guī)模雞場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，采用間接ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)禽流感抗體陽(yáng)性率進(jìn)行了分析；結(jié)果：(1)2013年至2015年間，蕪湖市禽流感免疫情況整體良好，血清抗體陽(yáng)性率平均達(dá)到81.9%，但2014年度春季免疫普查結(jié)果低于國(guó)家強(qiáng)制免疫要求；(2)抽檢的90個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)中，74個(gè)抗體陽(yáng)性率超過(guò)國(guó)家免疫要求，養(yǎng)雞場(chǎng)免疫合格率為82.2%；(3)蕪湖四區(qū)四縣中僅弋江區(qū)抗體陽(yáng)性率結(jié)果低于國(guó)家免疫要求，各區(qū)縣抽檢的血樣抗體陽(yáng)性率差異極顯著(P<0.01)；(4)三種類型養(yǎng)雞場(chǎng)抗體陽(yáng)性率存在差異極顯著(P<0.01)，肉雞場(chǎng)抽檢的血樣抗體陽(yáng)性率較低，需針對(duì)性加強(qiáng)免疫措施；結(jié)論：禽流感抗體水平監(jiān)測(cè)在蕪湖市重大動(dòng)物疫病的防控中起到了積極的預(yù)警和指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞：蕪湖；禽流感；抗體；酶聯(lián)免疫

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其劃為A類動(dòng)物疫病，并被列入國(guó)際衛(wèi)生武器公約動(dòng)物類傳染病名單[1]。禽流感病毒依據(jù)其外膜血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同而有許多亞型，目前已從禽類鑒定出16個(gè)HA亞型(H1～H16)，9個(gè)NA亞型(N1～N9)，根據(jù)靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)可將禽流感病毒亞型劃分高致病性禽流感、中致病性禽流感和低致病性禽流感，其中H5和H7兩個(gè)亞型可以引起高致病性禽流感，以傳播快、發(fā)病快、死亡率高為特征，也可傳染哺乳動(dòng)物甚至致人發(fā)病死亡[2]。我國(guó)從2004年起，在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)存欄禽類進(jìn)行高致病性禽流感強(qiáng)制免疫[3]，由于影響免疫的因素較多，免疫后抗體水平仍然需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析，為配合蕪湖市畜牧獸醫(yī)局的重大動(dòng)物疫病的免疫普查工作，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物保健中心于2013至2015年期間針對(duì)蕪湖市部分規(guī)模化雞場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)檢驗(yàn)，為蕪湖市禽流感的有效防控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1材料與方法

1.1血清采集

由蕪湖市畜牧獸醫(yī)局下轄各動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)站抽檢，每份血樣采集不少于0.5mL，并記錄血樣來(lái)源信息和編號(hào)，蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物保健中心收集整理，剔除溶血嚴(yán)重樣品，合格樣本2000 r/min 離心10 min分離血清，-20℃保存待測(cè)[4]。

1.2主要儀器

Thermo MK3酶標(biāo)儀，5424R離心機(jī)，國(guó)產(chǎn)高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、冰箱。

1.3試劑盒和判定標(biāo)準(zhǔn)

禽流感通用型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳康百得。采用間接ELISA法，操作程序按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行：樣品血清1 ∶100稀釋-抗原抗體孵育30min-洗板3次-酶標(biāo)二抗孵育30min-洗板3次-顯色反應(yīng)10min-終止，抗原包被板上每份樣品血清一孔，陽(yáng)性血清、陰性血清、空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)各兩孔，以空白對(duì)照調(diào)零，酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)波長(zhǎng)下(630nm作為參比波長(zhǎng))讀取各孔OD值。

結(jié)果按照試劑盒給出條件判定：(1)實(shí)驗(yàn)有效性判定，陰性對(duì)照孔OD值≤0.15、陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≥0.30，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效；(2)檢驗(yàn)結(jié)果判定(S/P=樣品OD值/陽(yáng)性對(duì)照平均OD值)，在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，若樣品S/P≥1.1，判為禽流感病毒抗體陽(yáng)性，若樣品S/P≤0.9，判為禽流感病毒抗體陰性，若樣品0.9

雞場(chǎng)免疫合格判定：該雞場(chǎng)抽檢的血樣抗體陽(yáng)性率≥70%(國(guó)家免疫要求)，則判斷該雞場(chǎng)免疫合格。

2檢測(cè)結(jié)果

血樣檢測(cè)結(jié)果按照年度、區(qū)縣、養(yǎng)殖類別分別進(jìn)行抗體陽(yáng)性率匯總，統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用軟件SPSS 16.0進(jìn)行R×C表卡方檢驗(yàn)(養(yǎng)殖場(chǎng)免疫合格率差異分析采用Fisher's Exact Test數(shù)據(jù)結(jié)果，血清抗體陽(yáng)性率差異分析采用Pearson Chi-Square數(shù)據(jù)結(jié)果)[5]。

2.1年度統(tǒng)計(jì)

2013年1月至2015年12月期間，為配合蕪湖市畜牧獸醫(yī)局春季防疫、秋季防疫的免疫普查工作，共檢測(cè)蕪湖市四區(qū)四縣90個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)的合格血樣893份，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

各年度春防，秋防免疫普查中共抽檢了90家養(yǎng)雞場(chǎng)，其中74家養(yǎng)雞場(chǎng)抽檢血樣的抗體陽(yáng)性率≥70%，16家養(yǎng)雞場(chǎng)免疫不合格(抗體陽(yáng)性率<70%)。不同年度間養(yǎng)雞場(chǎng)免疫合格率差異極顯著(χ2=10.447，0.01

各年度春防、秋防抽檢血樣的抗體陽(yáng)性率在50.6～96.7%，平均81.9%，年度間結(jié)果差異極顯著(χ2=139.000，P<0.01)，其中2014年春防免疫普查抽檢的血樣抗體陽(yáng)性率為50.6%，低于國(guó)家免疫要求。

表1　禽流感抗體檢測(cè)年度統(tǒng)計(jì)

2.2區(qū)縣統(tǒng)計(jì)

將血樣按照來(lái)源劃入鏡湖、弋江、鳩江、三山四個(gè)市屬轄區(qū)和蕪湖、繁昌、南陵、無(wú)為四縣，按照區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　禽流感抗體檢測(cè)區(qū)縣統(tǒng)計(jì)

結(jié)果顯示，蕪湖市屬區(qū)縣均存在少量養(yǎng)雞場(chǎng)的免疫不合格，其中三山區(qū)抽檢養(yǎng)雞場(chǎng)免疫合格率最高達(dá)94.7%，南陵縣最低為66.7%，但由于抽檢的雞場(chǎng)數(shù)目較少，各區(qū)縣雞場(chǎng)免疫合格率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.814，P>0.05)。

按照各區(qū)縣抽檢的血樣抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)，各區(qū)縣抽檢血樣抗體陽(yáng)性差異極顯著(χ2=44.971，P<0.01)，各地抽檢血樣抗體陽(yáng)性率在60%～91.5%，僅弋江區(qū)未達(dá)到國(guó)家免疫要求，抽檢血樣抗體陽(yáng)性率為60%。

2.3養(yǎng)殖類別統(tǒng)計(jì)

在抽檢的90家養(yǎng)雞場(chǎng)中，共25家蛋雞場(chǎng)、56家肉雞場(chǎng)、9家種雞場(chǎng)，將檢測(cè)結(jié)果按照不同養(yǎng)殖類別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，蛋雞場(chǎng)的免疫合格率最高為92%，其次是種雞場(chǎng)88.9%，最低為肉雞場(chǎng)免疫合格率76.8%，由于各養(yǎng)殖類別單位抽檢的數(shù)量較少，不同養(yǎng)殖類別養(yǎng)雞場(chǎng)的免疫合格率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.707，P>0.05)。

而以各養(yǎng)殖類別的血樣抗體陽(yáng)性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，蛋雞禽流感抗體陽(yáng)性率為91.0%，其次為種雞89.5%，而肉雞最低為76.7%，蛋雞、肉雞、種雞抗體陽(yáng)性率差異極顯著(χ2=27.369，P<0.01)。

表3　禽流感抗體檢測(cè)養(yǎng)殖類別統(tǒng)計(jì)

3結(jié)論與討論

本研究使用的是雞禽流感通用型ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果并不能區(qū)分是哪種亞型禽流感病毒疫苗引發(fā)的抗體，也不能確定是疫苗還是禽流感病毒引發(fā)的抗體，蕪湖市各規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，主要使用的是重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活苗、H7亞型二價(jià)滅活苗和H5+H9亞型二聯(lián)滅活苗等，市場(chǎng)上雖然也有具體亞型禽流感病毒抗體檢測(cè)試劑盒，但本研究重點(diǎn)考察疫苗的免疫后效果，并不強(qiáng)調(diào)病原檢測(cè)和亞型抗體分類，故在考慮實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)成本的前提下，采用雞禽流感通用型ELISA檢測(cè)試劑盒，而并未采用其他方法如血凝(HA)試驗(yàn)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)、PCR法等。

年度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，蕪湖市禽流感整體免疫情況良好，6次春防、秋防普查中，5次整體抗體合格率超過(guò)國(guó)家免疫要求，但在2014年度春防免疫普查中，抽檢15家養(yǎng)雞場(chǎng)，其中7家養(yǎng)雞場(chǎng)免疫不合格，其中弋江區(qū)1家，鳩江區(qū)、蕪湖縣、繁昌縣各2家，7家養(yǎng)雞場(chǎng)抽檢血樣的抗體陽(yáng)性率為0%或極低，調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于這7家養(yǎng)雞場(chǎng)，疫苗免疫時(shí)間和檢測(cè)時(shí)間間隔太短，抗體水平還未能顯著升高，后期應(yīng)重新對(duì)抗體水平進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。

區(qū)縣統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示蕪湖市屬四區(qū)四縣大部分雞場(chǎng)免疫合格，但各地均有少量雞場(chǎng)免疫不合格。弋江區(qū)抽檢血樣的抗體陽(yáng)性率為60%，未達(dá)到國(guó)家免疫要求，原因?yàn)檫瓍^(qū)僅抽檢4家養(yǎng)雞場(chǎng)共30份血清數(shù)量，其中1家養(yǎng)雞場(chǎng)抽檢了10份血樣抗體檢測(cè)全部陰性，調(diào)查發(fā)現(xiàn)這家養(yǎng)雞場(chǎng)送檢血樣為初次免疫肉雞，進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫即可提高抗體水平，所以結(jié)果并不能真實(shí)反映弋江區(qū)的禽流感免疫狀況。南陵縣抽檢分屬15家養(yǎng)雞場(chǎng)的血樣雖然抗體陽(yáng)性率整體達(dá)到80.7%，由于其中10家養(yǎng)雞場(chǎng)抗體陽(yáng)性率近100%，而5家養(yǎng)雞場(chǎng)免疫不合格，不足以抵御疫病風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)從業(yè)者和管理部門的重視，進(jìn)一步調(diào)整免疫程序和疫苗選擇，進(jìn)行補(bǔ)免加強(qiáng)并及時(shí)監(jiān)控免疫效果。

對(duì)蛋雞、肉雞、種雞三種類型養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三種類型養(yǎng)雞場(chǎng)都達(dá)到了國(guó)家免疫要求，肉雞場(chǎng)免疫合格率和抗體陽(yáng)性率均低于蛋雞場(chǎng)和種雞場(chǎng)，主要由于大部分蛋雞場(chǎng)、種雞場(chǎng)的規(guī)?；?、集約化、管理水平較高，免疫程序科學(xué)合理，部分肉雞場(chǎng)由于飼養(yǎng)周期短、免疫次數(shù)少，抗體陽(yáng)性率水平較低，更有部分肉雞場(chǎng)采用傳統(tǒng)散養(yǎng)或半散養(yǎng)方式，免疫難度大，免疫程序的制定及執(zhí)行存在一定的問(wèn)題，需根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，迅速制定和落實(shí)相關(guān)免疫措施，預(yù)防疫病風(fēng)險(xiǎn)。

抗體陽(yáng)性率在各雞場(chǎng)分布極不平衡，部分雞場(chǎng)禽流感的抗體陽(yáng)性率可達(dá)100%，而免疫情況差的雞場(chǎng)禽流感抗體陽(yáng)性率低至為0%，免疫存在較大的差異，原因在于各雞場(chǎng)的飼養(yǎng)管理、疫苗選擇和免疫程序制定以及雞群自身的健康水平差異較大。本研究通過(guò)抗體水平檢測(cè)，及時(shí)反饋各養(yǎng)雞場(chǎng)，并指導(dǎo)補(bǔ)免加強(qiáng)和后期監(jiān)測(cè)，使得免疫不合格的雞場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率均有大幅度提升，起到了良好的預(yù)警作用和指導(dǎo)作用，在2015年的春防、秋防檢測(cè)中，禽流感的抗體陽(yáng)性率，整體達(dá)到了90%以上。對(duì)于免疫情況良好的雞場(chǎng)，也不能放松警惕，應(yīng)當(dāng)根據(jù)免疫抗體消長(zhǎng)規(guī)律，間隔數(shù)月再次評(píng)估群體抗體水平，實(shí)現(xiàn)抗體水平監(jiān)測(cè)的常態(tài)化。

除了疫苗自身質(zhì)量原因以外，科學(xué)制定和嚴(yán)格執(zhí)行免疫程序規(guī)定的接種方式、時(shí)間、次數(shù)、接種量、操作方式、藥物影響[6]、盲目聯(lián)合應(yīng)用疫苗等[7]，以及疫苗的保管存放，也是免疫成敗的關(guān)鍵。另外，某些雞場(chǎng)疫苗接種時(shí)間和抗體檢測(cè)時(shí)間接近，抗體未能產(chǎn)生，也是檢測(cè)結(jié)果偏低的原因之一，應(yīng)根據(jù)疫苗免疫規(guī)律，再次檢測(cè)抗體水平，獲得合理評(píng)估結(jié)果。

本研究通過(guò)血清學(xué)調(diào)查，統(tǒng)計(jì)了近年來(lái)蕪湖市屬各區(qū)縣禽流感的抗體陽(yáng)性率，并分年度、區(qū)縣、養(yǎng)殖種類對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，基本掌握了蕪湖市禽流感的抗體水平分布情況，為禽流感的綜合防控措施提供了基礎(chǔ)依據(jù)，在本研究的警示和反饋指導(dǎo)下，蕪湖市2015年抽檢的養(yǎng)雞場(chǎng)免疫合格率和血樣抗體陽(yáng)性率較往年有較大提高，對(duì)地方重大動(dòng)物疫病的防控起到了積極作用。同時(shí)，本研究?jī)H進(jìn)行了禽流感抗體水平檢測(cè)，未進(jìn)行病毒抗原和抗體分型測(cè)定，在制定禽流感綜合防控措施時(shí)，需在抗體和抗原檢測(cè)的共同基礎(chǔ)上，加大免疫和監(jiān)測(cè)力度，并加強(qiáng)日常管理[8]，防范疫病風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)良性發(fā)展。

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(責(zé)任編輯：馬世堂)

Detection and Analysis of Avian Influenza Antibody in Large-scale Henneries of Wuhu City

ZHANG Dong-dong1, JI Mu-yin1, XU Di1, ZHANG Hai-yan1, XIAO Sheng1, YANG Yan-li2

(1.Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，China；2. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhu 241000，China)

Abstract：Immunization is the most important measure to prevent the outbreak of avian influenza. This paper studied antibody positive rate of bird flu in some large-scale henneries of Wuhu City by using Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) method during 2013 to 2015. The result showed that the overall situation of avian influenza immunization in Wuhu City was good from 2013 to 2015 during which serum antibody positive rate was 81.9%, but the 2014 annual spring immune census results is below the national mandatory immunization requirements. In the sampling of 90 chicken farms, 74 antibody positive rates were over the national immunization requirements, and the immunity percent of pass was 82.2%. The positive rate of serum antibody was significantly different among districts in Wuhu City (P<0.01), and only Yijiang District antibody positive rate was lower than the national immunization requirements. It also indicated the antibody positive rate of bird flu had significant differences in three types of henneries (P<0.01), that broiler farms need to strengthen immunization measures due to its lower antibody positive rate. This paper uses antibody detection to judge the immune effect and to guide the improvement of follow-up immunization measures which provided the basis for the comprehensive prevention and control of avian influenza in Wuhu City.

Key words:Wuhu; Avian Influenza; antibody; ELISA

中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-8772(2016)01-0025-05

作者簡(jiǎn)介：張冬冬(1983-)，男，安徽省定遠(yuǎn)縣人，碩士，講師，主要從事生化檢測(cè)研究。

基金項(xiàng)目：蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(WZ[2012]ky04)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目( KJ2016A765)。

收稿日期：2015-12-20