周　賡，鄧成剛，曹林友，陳　帥，田　云，盧向陽

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學東方科技學院，

湖南 長沙 410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128)

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一株耐鎘細菌的篩選、鑒定與性質研究

周賡1,3，鄧成剛1,2,3，曹林友1,2,3，陳帥1,2,3，田云1,3，盧向陽1,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學東方科技學院，

湖南 長沙 410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128)

摘要：從重金屬鎘污染土壤中分離篩選出一株耐鎘能力為25 mmol·L(-1)的細菌，根據(jù)形態(tài)學觀察、生理生化實驗和分子鑒定，確定為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)，命名為CdTB02。該菌株的最佳生長條件為：NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值6.0、溫度35 ℃；而在含1 mmol·L(-1) Cd(2+)的環(huán)境中，最佳耐鎘生長條件為：NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值7.0、溫度30 ℃。鎘吸附實驗結果顯示，菌株CdTB02在最佳耐鎘生長條件下對Cd(2+)的吸附率達到94%以上，表明菌株CdTB02對治理鎘污染能發(fā)揮一定的作用。

關鍵詞：鎘污染；耐鎘細菌；鞘氨醇單胞菌屬；耐受性；吸附率

近年來，隨著采礦、電鍍、金屬冶煉、化肥和農(nóng)藥等相關行業(yè)的不斷發(fā)展，大量有毒重金屬直接或間接地被釋放進入環(huán)境，它們持續(xù)地對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成巨大的影響和危害[1]。鎘(Cd)是環(huán)境中一種常見的有毒重金屬，對人類和動物的健康都能造成持續(xù)性的危害[2-3]。近年來，隨著鎘使用量的增加、鎘污染土壤面積不斷擴大以及鎘污染的食品沒有得到充分合理的處理，使得人們接觸鎘的風險日益增加[4]。因此，鎘污染的治理成為急需解決的問題。

用于鎘污染治理的常規(guī)方法包括：電化學處理法、離子交換法、化學沉淀法、反滲透和吸附法等，但是這些物理和化學方法都受到技術和成本的約束，而且處理過程中釋放的化學物質和處理后的副產(chǎn)品容易對環(huán)境造成二次污染，因此，需要用效益更高和更環(huán)保的生物方法來處理鎘污染[5]。人們開始不斷探索更多的生物修復方法[6-7]。其中細菌、真菌和藻類等微生物由于具有比表面積大、繁殖迅速、代謝能力旺盛、種類多、適應性強、易擴大培養(yǎng)且生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢，其在鎘污染治理中的獨特地位逐漸受到人們的重視[8-10]。

目前，耐鎘微生物的篩選越來越受到專家學者的關注。大量的耐鎘和具有鎘吸附作用的微生物通過傳統(tǒng)的分離篩選手段被發(fā)現(xiàn)，這些微生物主要屬于Pseudomonassp.、Cupriavidus metallidurans、Bacillus cereus和Enterococcus faecalis等[11-13]。Zhang等[3]篩選得到了33株具有抗鎘毒性的乳酸菌，其中Lactobacillus plantarumCCFM8610耐鎘能力最強，能達到1 000mg·L-1，對鎘離子的吸附率達到31.34%。Limcharoensuk等[14]從鋅礦山土壤中分離篩選得到Pseudomonas aeruginosaB237，對鎘離子有明顯的吸附能力，其對Cd2+最大吸附能力為16.89mg·g-1。Surasak等[15]同樣從鋅礦區(qū)的土樣中篩選得到24株耐鎘細菌，其平均耐受CdCl2能力達到2.5mmol·L-1。

鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)對芳香化合物的代謝能力極強[16]，并且該菌屬某些菌種能夠合成有價值的胞外生物高聚物。所以該菌株通常作為降解有機污染物的一類環(huán)保細菌被學者們所認識[17]。但是關于其耐鎘特性方面的研究報道較少。

作者從湘西鎘污染的土壤中篩選了一株耐鎘細菌CdTB02，對其進行了鑒定和生長條件的優(yōu)化，并對其在鎘環(huán)境中的生長情況以及該菌株對Cd2+的吸附能力進行研究，擬為該菌株在生物修復鎘污染環(huán)境中的應用提供理論依據(jù)。

1實驗

1.1土壤樣品采集

采樣點：湖南省湘西鳳凰縣、古丈縣、瀘溪縣3個重金屬鎘污染地區(qū)。

采樣方法：各采樣點取5～10cm表層重金屬鎘污染土樣，將其混合均勻后備用。

1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl10g，酵母膏10g，瓊脂12g，調節(jié)pH值為7，加濃度為1mol·L-1的CdCl2溶液10mL，定容至1 000mL，121 ℃下滅菌20min，倒平板。

篩選培養(yǎng)基：配制Cd2+濃度分別為10mmol·L-1、15mmol·L-1、20mmol·L-1、25mmol·L-1、30mmol·L-1的分離培養(yǎng)基。

1.3耐鎘細菌的分離

取10g鎘污染混合土樣置于500mL三角瓶中，加入100mL去離子水和20顆小玻璃珠，置于200r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中處理1h，靜置10min，取上層懸液稀釋至10-4、10-5、10-6數(shù)量級，吸取稀釋液涂布在含Cd2+濃度為10mmol·L-1的平板上，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結果。

1.4耐鎘細菌的篩選

挑取平板上的單菌落，分別在Cd2+濃度為10mmol·L-1、15mmol·L-1、20mmol·L-1、25mmol·L-1、30mmol·L-1的平板上劃線，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復上述操作得到鎘耐受能力最強的細菌。

1.5耐鎘細菌的鑒定

1.5.1形態(tài)及生理生化鑒定

參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]、《微生物學實驗教程》[19]、《污染土壤生物修復理論基礎與技術》[20]以及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]等對耐鎘細菌進行鑒定。

1.5.216S rDNA序列分析

采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取細菌CdTB02的總基因組DNA，擴增細菌CdTB02的16S rDNA，設計引物為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反應體系為：5 μL的10×buffer，0.25 μL的Ex Taq DNAase，4 μL的 dNTP，2 μL的引物，2 μL的模板，總反應體系為50 μL。PCR條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。回收PCR擴增產(chǎn)物，將其連接到pMD18-T vector上，經(jīng)陽性鑒定后送華大基因公司進行測序。

1.6生長條件對菌株CdTB02生長和耐鎘的影響

分別測試菌株CdTB02在250 mL三角瓶中不同裝液量(10 mL、30 mL、50 mL、70 mL、90 mL)、不同NaCl濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%)、不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)條件下的生長情況和在含鎘濃度為1 mmol·L-1的上述不同液體培養(yǎng)基中的生長情況。接種母液OD600均為1，接種量為2%，于轉速200 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，每組設3個平行。

1.7最佳耐鎘生長條件下菌株CdTB02的鎘吸附實驗

配制100 mL LB液體培養(yǎng)基，加鎘使培養(yǎng)基中Cd2+的初始濃度分別為100 mg·L-1、500 mg·L-1、900 mg·L-1、1 300 mg·L-1、1 700 mg·L-1，先分別取2 mL培養(yǎng)基作為對照，再以2%接種量接種，接種母液OD600為1，于30 ℃、200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)24 h，離心后取上清液2 mL做消化。

消化方法：將消化管洗凈，烘干。取待測樣加入消化管中。稱取硫酸銅0.5 g、硫酸鉀6 g、濃硫酸12 mL于消化管中。做一個空白對照，將對照組樣品加入消化管中，其它條件相同。將消化管放入儀器上進行消化。調整溫度為350～400 ℃，待顏色變?yōu)槌吻?大約2 h以上)，再繼續(xù)加熱0.5 h，關閉儀器，將消化管靜置、冷卻至室溫。消化后采用TAS-986原子吸收分光光度計火焰法測定鎘濃度。

菌株CdTB02對鎘的吸附率(%)和吸附量(mg·L-1)的計算公式如下：

吸附量=(Cd2+初始濃度-吸附后Cd2+濃度)×0.1

2結果與討論

2.1耐鎘細菌的篩選與鑒定

通過對鎘污染土壤中微生物進行鎘耐受性篩選，得到一株耐鎘細菌，命名為CdTB02，該菌的最大鎘耐受濃度為25 mmol·L-1。對菌株CdTB02進行形態(tài)學和生理生化鑒定，結果見表1。菌株CdTB02總DNA和16S rDNA擴增的部分電泳結果見圖1。

由圖1可知，菌株CdTB02的16S rDNA序列全長為1 451 bp。將測定所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，通過在線序列BLAST比對檢索，構建CdTB02菌株系統(tǒng)進化樹，見圖2。

表1耐鎘細菌CdTB02的生化特征

Tab.1

Biochemical properties of the cadmium

注：“+”為陽性反應,“-”為陰性反應。

圖1　菌株CdTB02總DNA(a)和16S rDNA擴增(b)電泳圖

圖2　菌株CdTB02與其它相關細菌的系統(tǒng)進化樹

結合該菌株的形態(tài)學、生理生化鑒定，并參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]，確定耐鎘細菌CdTB02為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)。

2.2生長條件對菌株CdTB02的生長和鎘耐受能力的影響(圖3)

圖3NaCl濃度、裝液量、pH值和溫度對菌株CdTB02生長和鎘耐受能力的影響

Fig.3Effects of NaCl concentration,liquid loading,pH value and temperature on growth and cadmium resistance of CdTB02

培養(yǎng)微生物時，培養(yǎng)基中NaCl含量與細胞滲透壓密切相關；裝液量的多少會影響培養(yǎng)基中溶解氧的含量，進而影響微生物的呼吸作用和某些代謝產(chǎn)物的合成；pH值和溫度直接影響微生物相關代謝酶的活性。由圖3a可知，無論環(huán)境中是否含有鎘離子，隨著NaCl濃度的升高，菌株CdTB02的生長都會受到抑制，在NaCl濃度為5%以上時，菌株CdTB02不能生長，其生長最佳NaCl濃度為1%；菌株CdTB02在含鎘環(huán)境中的生長情況優(yōu)于不含鎘的環(huán)境，說明NaCl能提高該菌株的鎘耐受能力。由圖3b可知，菌株CdTB02在裝液量30 mL/250 mL時生長狀況最好，但裝液量對該菌株鎘耐受能力影響不大。由圖3c可知，菌株CdTB02適合在中性或偏酸性條件下生長，pH值為9.0時該菌停止生長，說明pH值過高會嚴重抑制菌體生長；pH值為6.0時該菌生長最佳，含鎘環(huán)境下pH值為7.0時該菌生長最佳；在堿性環(huán)境中pH值對菌株CdTB02的鎘耐受能力影響小，偏酸性環(huán)境中會降低其鎘耐受能力。由圖3d可知，菌株CdTB02最佳生長溫度為35 ℃，而含鎘環(huán)境中最佳生長溫度為30 ℃。

2.3最佳耐鎘生長條件下菌株CdTB02的鎘吸附能力

在最佳耐鎘生長條件下，即NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值7.0、溫度30 ℃時，測定菌株CdTB02的鎘吸附量和吸附率，結果見表2。

由表2可知，菌株CdTB02對鎘的吸附率均高于94.736%，表明該菌的細胞內有較多的活性酶，能提高代謝效率，使細胞與鎘的結合率提高，并且呼吸作用提供了足夠的能量以運輸鎘離子進入細胞[6，12]。Cd2+初始濃度為500 mg·L-1時，菌株CdTB02對Cd2+的最高吸附率為97.659%，隨著Cd2+濃度的升高，菌株CdTB02對Cd2+的吸附率呈下降趨勢，表明菌株CdTB02對鎘的吸附能力有限，Cd2+濃度過高會影響菌株CdTB02對鎘的吸附能力。

表2

菌株CdTB02的鎘吸附量和吸附率

Tab.2

Cadmium adsorption amount and cadmium

3結論

采用常規(guī)純培養(yǎng)方法從重金屬鎘污染土壤中分離篩選耐鎘微生物，并獲得一株耐鎘能力強的細菌CdTB02，該菌株能在含25 mmol·L-1Cd2+的LB固體培養(yǎng)基中生長。通過形態(tài)學觀察、生理生化實驗及分子鑒定，確定該菌株為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CdTB02最佳生長條件為：NaCl濃度1%，裝液量30 mL/250 mL，pH值6.0，溫度35 ℃；而在含1 mmol·L-1Cd2+的環(huán)境中，最佳耐鎘生長條件為：NaCl濃度1%，裝液量30 mL/250 mL，pH值7.0，溫度30 ℃。該菌株在有無鎘的環(huán)境下均生長良好，說明該菌鎘耐受能力強。在最佳生長條件下，菌株CdTB02對Cd2+的最高吸附率為97.659%，表明該菌株對Cd2+有較強的吸附能力，具有在鎘污染治理中應用的潛力。

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Screening,Identification and Characterization of A Cadmium Resistant Strain

ZHOU Geng1,3,DENG Cheng-gang1,2,3,CAO Lin-you1,2,3,CHEN Shuai1,2,3,TIAN Yun1,3,LU Xiang-yang1,3

(1.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China；2.CollegeofOrientScience&Technology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China；3.HunanAgriculturalBioengineeringResearchInstitute，Changsha410128,China)

Abstract：In this paper,a strain with maximum cadmium tolerated concentration of 25 mmol·L(-1) was isolated from the soil of heavy metal cadmium polluted area.It was identified as Sphingomonas sp. and named as CdTB02 by morphological observation,physiological-biochemical identification and molecular identification.The optimum growth conditions for strain CdTB02 were as follows：NaCl concentration of 1%,liquid loading of 30 mL/250 mL,pH value of 6.0 and temperature of 35 ℃.In the environment of containing 1 mmol·L(-1) Cd(2+),the optimum growth conditions of cadmium resistance were as follows：NaCl concentration of 1%,liquid loading of 30 mL/250 mL,pH value of 7.0 and temperature of 30 ℃.Cadmium adsorption experiment showed that the adsorption rate of Cd(2+)was more than 94% under the optimum growth conditions of cadmium resistance，which indicated that the strain CdTB02 could play an important role in the treatment of cadmium pollution.

Keywords：cadmium pollution;cadmium resistant bacteria;Sphingomonas sp.;tolerability;adsorption rate

中圖分類號：X 703

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0043-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.012

作者簡介：周賡(1989-)，男，湖南津市人，碩士研究生，研究方向：應用微生物學，E-mail：1019583003@qq.com；通訊作者：田云，教授，E-mail：tianyun79616@163.com；盧向陽，教授，E-mail：xiangyangcn@163.com。

收稿日期：2015-12-02