馬明蘭，劉　陽(yáng)，蔡麗娜，張　琳，譚珺雋

(武昌理工學(xué)院 湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223)

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桑葚多糖的提取研究

馬明蘭，劉陽(yáng)，蔡麗娜，張琳，譚珺雋

(武昌理工學(xué)院 湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223)

摘要：采用沸水浸提法提取桑葚多糖，用醇沉法析出粗多糖后利用5%三氯醋酸脫蛋白純化得精制桑葚多糖。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提時(shí)間0.5 h，乙醇濃度90%，優(yōu)化的5%三氯醋酸脫蛋白液料比為875∶1(mL∶g)。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行20倍放大實(shí)驗(yàn)，精制桑葚多糖提取率可達(dá)2.63%。采用苯酚-硫酸法對(duì)桑葚多糖含量進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖溶液為對(duì)照品溶液，在490 nm處測(cè)得吸光度與濃度線性關(guān)系良好(R=0.9997)；測(cè)定溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD=1.02%)，重復(fù)性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值為99.67%(RSD=0.93%)。該測(cè)定方法線性、精密度、準(zhǔn)確度均滿足測(cè)定要求，并且方法簡(jiǎn)單、成本低，值得廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：桑葚多糖；提??；醇沉法；苯酚-硫酸法；含量測(cè)定

桑葚是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值的食品，也是我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，具有滋陰補(bǔ)血、抗氧化、生津、潤(rùn)腸、降血糖和降血壓的功效[1]，主要含有桑葚多糖、蘆丁、白黎蘆醇、蘜酸、原花色素、維生素和揮發(fā)油[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，桑葚多糖具有降血糖、抗氧化等多種潛在的藥用價(jià)值。從桑葚中提取多糖并將其制成經(jīng)濟(jì)效益高的降糖藥物或保健品，能充分發(fā)揮我國(guó)豐富的桑葚等藥用植物資源優(yōu)勢(shì)，造福大眾健康。作者采用沸水浸提法提取桑葚多糖，并優(yōu)化了提取工藝條件。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

桑葚，購(gòu)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥店。

葡萄糖對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；石油醚、95%乙醇、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、無(wú)水丙酮、三氯醋酸、濃硫酸、苯酚，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津；BT224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；J-26XP型高速冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)中國(guó)有限公司。

1.2方法

1.2.1多糖的提取

桑葚→除雜質(zhì)→烘干→搗碎→稱量→石油醚脫脂1h→冷卻抽濾→沸水浸提→旋轉(zhuǎn)濃縮→醇沉過(guò)夜→抽濾→粗多糖。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)多糖提取率影響較大的料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)為考察因素，以桑葚多糖提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1

正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1

The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2多糖的精制

將粗多糖分別用無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、無(wú)水丙酮洗滌3次，然后加入一定量的5%三氯醋酸除去蛋白，離心，取上清液，再濃縮，加入乙醇使其含量達(dá)到80%，放入冰箱靜置12 h，離心，干燥，得精制桑葚多糖，測(cè)定多糖含量。

1.2.3桑葚多糖含量的測(cè)定

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖對(duì)照品10.03 mg置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.1003 mg·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液，分別取0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL葡萄糖對(duì)照品溶液，分別加蒸餾水2.0 mL、1.8 mL、1.7 mL、1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL，搖勻，再分別精密加入剛配制的5%苯酚溶液1 mL，搖勻，分別緩慢滴加濃硫酸5 mL，邊滴加邊振蕩，然后在40 ℃水浴中加熱30 min，冷卻，以空白試劑作參比，在400～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，以最大吸收峰處波長(zhǎng)(490 nm)作為測(cè)試波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度(A)，繪制A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2桑葚多糖含量的測(cè)定

精密稱取桑葚多糖0.1 g，加100 mL水溶解，再稀釋20倍，按照苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度，以空白試劑作參比，在490 nm處測(cè)定A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葚多糖濃度，進(jìn)而計(jì)算桑葚多糖提取率[3]。

1.2.4方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.2.4.1穩(wěn)定性

精密量取一定量的桑葚多糖溶液，按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作，分別在490 nm處間隔0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min測(cè)定A，計(jì)算RSD。

1.2.4.2精密度

精密量取6份等體積的桑葚多糖溶液，按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作，測(cè)定A，計(jì)算RSD。

1.2.4.3準(zhǔn)確度

精密稱取桑葚多糖0.025 g和葡萄糖對(duì)照品0.050 g、桑葚多糖0.050 g和葡萄糖對(duì)照品0.050 g、桑葚多糖0.075 g和葡萄糖對(duì)照品0.050 g各3份，混勻，按照1.2.3.2的方法配制樣品待測(cè)液，混勻，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作，分別測(cè)定A，計(jì)算回收率。

2結(jié)果與討論

2.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.2The results and analysis of orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC多糖提取率/%1#1113.172#1221.893#1331.384#2124.215#2232.916#2313.957#3133.588#3211.959#3323.25k12.1453.6533.006k23.6892.2323.116k32.9112.8602.623R1.5441.4210.493

由表2可知，各因素對(duì)多糖提取率影響大小順序?yàn)椋毫弦罕?浸提時(shí)間>乙醇濃度，最佳提取工藝條件為A2B1C2，即料液比1∶6(mg∶mL)、浸提時(shí)間0.5 h、乙醇濃度90%。在最佳提取工藝條件下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，多糖提取率分別為4.16%、4.30%，與正交表中4#實(shí)驗(yàn)提取率4.21%比較，平均值為4.22%，RSD值為1.68%，說(shuō)明提取工藝穩(wěn)定。

將該工藝放大20倍，取干桑葚200 g實(shí)驗(yàn)，多糖提取率為4.63%。和小試數(shù)據(jù)相比，放大實(shí)驗(yàn)提取率相對(duì)較高，這可能是因?yàn)榉糯蠛?，稱量及實(shí)驗(yàn)誤差降低，這不影響最佳工藝路線的選擇。

2.2精制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取放大實(shí)驗(yàn)得到的桑葚多糖粗品進(jìn)行精制實(shí)驗(yàn)，測(cè)定桑葚多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，5%三氯醋酸量為取樣量的875倍時(shí)，去蛋白效果最佳，桑葚多糖含量最高，為72.02%。依照該方案對(duì)放大實(shí)驗(yàn)剩余樣品進(jìn)行去蛋白操作，最終制得桑葚多糖含量為73.18%，與上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本吻合，因此確定該工藝為去蛋白最佳工藝。

2.3多糖含量測(cè)定結(jié)果

按照1.2.3的測(cè)定方法，測(cè)定并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

擬合線性回歸方程為y=0.0079x+0.0692(R=0.9997)，說(shuō)明葡萄糖濃度在20.06～60.18 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，可用于桑葚多糖含量的測(cè)定。

表3

去蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3

The results of deproteinization

圖1葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.1The standard curve of glucose

精制各次所得桑葚多糖粗品，測(cè)定其桑葚多糖含量，計(jì)算桑葚多糖提取率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4

多糖含量和提取率的測(cè)定結(jié)果/%

Tab.4

The results of content and extraction rate of polysaccharide/%

注：1#～9#是正交實(shí)驗(yàn)編號(hào)，平行1、2為最佳條件下的實(shí)驗(yàn)。

2.4方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.1穩(wěn)定性(表5)

由表5可知，180 min內(nèi)測(cè)定7次的吸光度的平均值為0.388，RSD為1.02%，表明穩(wěn)定性良好。

2.4.2重復(fù)性(表6)

由表6可知，6次測(cè)定的多糖含量平均值為35.68%，RSD為1.22%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3準(zhǔn)確度(表7)

由表7可知，方法的回收率平均值為99.67%，RSD為0.93%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表5

溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5

The results of solution stability experiment

表6

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.6

The results of repeated experiment

3結(jié)論

采用沸水浸提法提取桑葚多糖，確定優(yōu)化的工藝條件為：料液比1∶6(mg∶mL)，浸提時(shí)間0.5 h，乙醇濃度90%，5%三氯醋酸去蛋白最佳液料比為875∶1(mL∶g)。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行20倍放大實(shí)驗(yàn)，并對(duì)所得桑葚多糖進(jìn)行精制，多糖提取率可達(dá)2.63%。

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行桑葚多糖含量測(cè)定，以葡萄糖溶液為對(duì)照品溶液，在490 nm處測(cè)得吸光度與濃度線性關(guān)系良好(R=0.9997)；測(cè)定溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD=1.02%)，重復(fù)性良好(RSD=1.22%)，回收率平均值為99.67%(RSD=0.93%)。該測(cè)定方法線性、精密度、準(zhǔn)確度均滿足測(cè)定要求，并且方法簡(jiǎn)單、成本低，值得廣泛應(yīng)用。

表7回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.7

The results of recovery experiment

參考文獻(xiàn)：

[1]王強(qiáng)，王睿，王存，等.桑葚多糖調(diào)節(jié)血糖代謝及體外抗氧化效果研究[J].食品科學(xué)，2014，35(11)：260-264.

[2]劉玉玲，紀(jì)國(guó)力.桑葚中多糖的提取及含量的測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012，2(18)：109-110.

[3]鄭曉艷，林藝華.中藥多糖的提取、分離純化及其含量測(cè)定方法概述[J].福建分析測(cè)試，2013，22(4)：58-62.

Extraction and Content Determination of Mulberry Polysaccharide

MA Ming-lan,LIU Yang,CAI Li-na,ZHANG Lin,TAN Jun-jun

(EngineeringTechnologyResearchCenterofBiologicalPeptideAntidiabeticsofHubeiProvince,WuchangUniversityofTechnology,Wuhan430223，China)

Abstract：Mulberry polysaccharide was extracted by hot water extraction,crude polysaccharide was obtained by alcohol precipitation method,and protein was further removed by 5% trichloroacetic acid to prepare purified mulberry polysaccharide.Through an orthogonal experiment,the optimal conditions of extraction were as follows:solid-liquid ratio of 1∶6(mg∶mL),extraction time of 0.5 h,ethanol concentration of 90%,and 5% trichloroacetic acid with liquid-solid ratio of 875∶1(mL∶g) to deprotein.For 20 times scale-up experiment,the extraction rate of purified polysaccharide could reach 2.63%.Mulberry polysaccharide content was determined by a phenol-sulfuric acid method.Using glucose solution as the reference substance solution,there was a good linear relationship(R=0.9997) between the absorbance at 490 nm and the concentration,the solution had good stability within 3 h(RSD=1.02%),It had good repeatability(RSD=1.22%),and the average recovery rate was 99.67%(RSD=0.93%).This method meets the requirements of linearity,precision and caauracy,and the method is simple,low-cost and with wide applications.

Keywords：mulberry polysaccharide;extraction;alcohol precipitation method;phenol-sulfuric acid method;content determination

基金項(xiàng)目：湖南省環(huán)保廳資助項(xiàng)目(湘財(cái)建指[2014]287號(hào))，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(DFCXY201308)

中圖分類號(hào)：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)03-0039-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.011

作者簡(jiǎn)介：馬明蘭(1982-)，女，湖北宜昌人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：化學(xué)合成，E-mail：yuebianxing82@163.com。

收稿日期：2015-10-30