丁　濤，王　芳

(1.延安大學(xué) 陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué)石油學(xué)院，陜西 延安 716000)

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一種用于監(jiān)控葡萄糖濃度的嵌入式光學(xué)生物傳感器

丁濤1，王芳2

(1.延安大學(xué) 陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000；2.延安大學(xué)石油學(xué)院，陜西 延安 716000)

摘要：由于在持續(xù)流動(dòng)條件下連續(xù)監(jiān)測血糖濃度較為困難，提出了2種硅橡膠(聚二甲基硅氧烷)光子生物傳感器設(shè)計(jì)方法，分別是內(nèi)部固定光子生物傳感器和對(duì)內(nèi)部固定光子生物傳感器進(jìn)行改進(jìn)，將微珠腔與玻璃粉填充渠道綜合的外部固定光子生物傳感器。結(jié)果顯示，前者內(nèi)部固定光子生物傳感器可檢測濃度為0.26～5.00 mg·L(-1)的葡萄糖，R2=0.9905；后者通過外部固定聯(lián)合方法固定大量的酶于玻璃粉上，加快了傳感器腔內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的速率，在連續(xù)流動(dòng)情況下，可檢測濃度為0.7～10.0 mg·L(-1)的葡萄糖，R2=0.9845。外部固定光子生物傳感器在光子芯片實(shí)驗(yàn)室的在線分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：葡萄糖；酶；玻璃粉(微珠)；生物傳感器

采用微系統(tǒng)技術(shù)的微流體設(shè)備在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著獨(dú)特的應(yīng)用。目前，面向于一臺(tái)集成在一個(gè)芯片上的微型化實(shí)驗(yàn)室裝置或設(shè)備引起了許多研究人員的興趣，陸續(xù)出現(xiàn)了很多微型設(shè)備(如泵、加氣機(jī)、生物傳感器等)[1-2]。在這些設(shè)備中，微生物傳感器因?qū)?xì)胞、抗體、DNA和酶作用物(如葡萄糖、乙醇、過氧化氫等)的檢測效果極佳而對(duì)于芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的發(fā)展影響重大[3]。

1962年，Clark和Lyons提出了葡萄糖酶電極[4]。自此，基于良好的經(jīng)濟(jì)前景預(yù)測，出現(xiàn)了很多葡萄糖生物傳感器的設(shè)計(jì)和檢測原理[5]。

第一代葡萄糖生物傳感器為葡萄糖氧化酶(GOX)傳感器[6]。GOX固定在聚丙烯酰胺凝膠上形成氣體滲透膜覆蓋電極[7]，用電化學(xué)方法檢測到氧氣濃度降低，以此作為葡萄糖濃度降低的指示器。

由于檢測的含氧量有波動(dòng)，這種方法被電化學(xué)法檢測氧化產(chǎn)物過氧化氫所取代[8]。但是在較高的陽極電位下檢測過氧化氫或氧氣時(shí)，容易氧化相鄰的分子，導(dǎo)致這種生物傳感器無法完全準(zhǔn)確地用于葡萄糖濃度的檢測。

為了解決這一難題，第二代傳感器應(yīng)運(yùn)而生，這種傳感器用其它濃度易控的氧化性介質(zhì)取代氧氣[9]。它們可以使酶的活性部分與電極表面發(fā)生反應(yīng)，并且以電子的形式穿梭于酶與電極之間。電化學(xué)信號(hào)的檢測取決于介質(zhì)的氧化。這種系統(tǒng)使得傳感不依靠于氧氣，即如果系統(tǒng)中的氧不充分，葡萄糖濃度的檢測可以獨(dú)立于氧氣。

光學(xué)微芯片生物傳感器常用來與固定的葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶(GOX-HRP)、醇氧化酶-辣根過氧化物酶(AOX-HRP)聯(lián)合檢測產(chǎn)生于蔗糖與固定酵母細(xì)胞的動(dòng)態(tài)的葡萄糖和乙醇。即連續(xù)不斷地監(jiān)測流過傳感器的固定聯(lián)合酶，這種酶可以催化一系列的反應(yīng)，以HRP催化發(fā)光氨的氧化產(chǎn)生化學(xué)熒光結(jié)束。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GOX-HRP生物傳感器可以在正常情況下使用5d，而AOX-HRP傳感器需要不斷地校正以防止它隨著時(shí)間的推移而失去活性。

另一方面，已成功生產(chǎn)出在硅橡膠基片上使用硅橡膠導(dǎo)波管制造的完整的光學(xué)葡萄糖傳感器，并且得到測試。許多導(dǎo)波管用熱的方法制造成表面被處理過的PDM單塊集成電路導(dǎo)波管系統(tǒng)，并焊接在硅膠基片上[10]。然后它們被連接到一個(gè)發(fā)光二極管(LED)上，這個(gè)LED將波長小于450nm的光注入到導(dǎo)波管。在這個(gè)波段氧敏釕極易吸收染色并且發(fā)射波長小于610nm的光。這個(gè)傳感系統(tǒng)使氧敏染色三異丙基乙磺酰和葡萄糖酶相結(jié)合。這個(gè)染色/酶系統(tǒng)使用逐層自組裝的方法固定在導(dǎo)波管表面。染色/酶系統(tǒng)會(huì)與周圍環(huán)境發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生變化，使用的監(jiān)控方法是檢測端面與被注入到導(dǎo)波管中的光發(fā)生的反應(yīng)。這種傳感器整體靈敏度過低。傳感器的低靈敏度和熒光強(qiáng)度有關(guān)，原因是葉片脫模故障和大多數(shù)分光儀的靈敏度較低。

最近的研究表明，微型生物傳感器(如迷你/微米設(shè)備)具有快速分析、并行化、低成本、可移植性和微量的試劑消耗等優(yōu)點(diǎn)。這種技術(shù)基于內(nèi)外部聯(lián)合固定的GOX和HRP在光激性葡萄糖生物傳感器上得以實(shí)現(xiàn)。內(nèi)部的固定聯(lián)合是在內(nèi)部傳感器腔的硅橡膠表面，而外部的固定聯(lián)合是在功能化硅膠的微小顆粒上[11]。外部的微小顆粒固定有很多優(yōu)點(diǎn)，例如大的比表面積可以提高酶的活性。此外，大量的顆?？梢员还潭?，適用于多種芯片。與每個(gè)測試硅橡膠芯片直接固定技術(shù)相比，這種技術(shù)可以降低成本、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

1原理

酶是具有生物催化功能的特殊蛋白質(zhì)，可通過降低活化能加速生物化學(xué)反應(yīng)，具有在不改變結(jié)構(gòu)配置的情況下可以存活數(shù)反應(yīng)周期的優(yōu)點(diǎn)。檢測葡萄糖使用了很多的組分酶，如GOX或葡萄糖脫氫酶。

GOX催化一系列的反應(yīng)，使得基質(zhì)被氧氣氧化產(chǎn)生過氧化氫。在富氧條件下，GOX催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫[4]。因此，通過檢測氧氣的消耗或者過氧化氫的生成，可以直接測定葡萄糖濃度。

在該研究中過氧化氫和HRP被看作是葡萄糖濃度測定的指示劑。HRP被廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)領(lǐng)域，通常催化過氧化氫與基底反應(yīng)發(fā)生顯色或發(fā)光。反應(yīng)式如下：

在所有實(shí)驗(yàn)中，3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)被當(dāng)作一個(gè)基底。借助于光學(xué)測定TMB的氧化形式分析濃度。

2實(shí)驗(yàn)

2.1材料與試劑

光阻SU-8 5和SU-8 50以及它們的甲基丙二醇溶液或醋酸酯(PGMEA)溶液，Micro Chem Corporation。彈性為184的硅橡膠硅酮樹脂，Dow Corning公司。

葡萄糖氧化酶(GOX，G7141-50KU產(chǎn)品)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、醋酸鹽緩沖溶液(pH=4.6)、辣根過氧化物酶(HRP，型號(hào)4)、醋酸鈉緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、戊二醛，Sigma-Aldrich有限公司。

2.2傳感器的制備

光子葡萄糖生物傳感器采用紫外線(UV)光刻技術(shù)，使用SU-8光刻膠作為背面主體對(duì)硅橡膠模型進(jìn)行軟光刻處理。主體在厚度700 μm的鈉石灰玻璃襯底上進(jìn)行雙面光刻處理。制備過程是：先把基底放在120 ℃電烤爐中加熱1 h以清潔和脫水，然后在一個(gè)桶狀的蝕刻器中進(jìn)行氧等離子體活化。

光刻工藝的第一步是在襯底上將SU-8 5以3 000 r·min-1旋涂30 s，在95 ℃下干燥10 min。之后SU-8層溢出暴露在紫外光下，在95 ℃下烤10 min，得到一層厚度約5 μm的膜，可充當(dāng)一個(gè)粘附促進(jìn)劑和種子層結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)涂布層之前, 種子層在氧等離子體中激活。

傳感器主體使用SU-8 50光刻膠處理雕刻2次，每次用4 mL光刻膠以1 200 r·min-1瞄準(zhǔn)平面板捻成絲狀，然后在95 ℃下干燥，獲得一層總厚度為230 μm的基底，暴露在紫外光下100 s并且在95 ℃下烤20 min。暴露的主體靜置一夜后放入丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)中。

這個(gè)主體的復(fù)制品是用硅橡膠加工成型的，硅橡膠預(yù)聚合物是用體積比為1∶10的固化劑與彈性基礎(chǔ)混合?；旌衔锍馀莺蠊嗳胫黧w內(nèi)部，在80 ℃下加熱30 min，最終從主體上剝落。硅橡膠生物傳感器模具固定在玻璃片上，然后連上進(jìn)口和出口。

2.3固定聯(lián)合方法

酶(HRP,GOX)的固定聯(lián)合是直接影響葡萄糖傳感器性能的一個(gè)關(guān)鍵因素。很多固定聯(lián)合方法，如：簡單吸附法、共價(jià)鍵結(jié)合法[聚乙二醇(PEG)，在硅橡膠腔的內(nèi)表面，酶與外部的功能硅微粒以共價(jià)鍵結(jié)合]，都被檢查使用過。固定聯(lián)合方法直接影響到后續(xù)的操作。

2.3.1在硅橡膠上進(jìn)行內(nèi)部的固定聯(lián)合

GOX和HRP直接共價(jià)固定在傳感器腔硅橡膠的內(nèi)表面。為了檢查硅橡膠表面有效酶的固定，有2個(gè)檢查程序：簡單的化學(xué)吸附法和聚乙二醇(PEG)/11-三乙氧基硅基十一醛(11-TESU)共價(jià)捆綁法。

化學(xué)吸附法是最簡單和快速的方法。在此過程中，0.001 mg HRP與0.001 mg GOX溶解在聚丁二酸丁二醇酯中，室溫下在傳感器腔中簡單培養(yǎng)1 h。

使用PEG實(shí)現(xiàn)其它程序的目的是表面處理中避免酶盲目地綁定在硅橡膠上，同時(shí)改善固定聯(lián)合的效果。PEG是一個(gè)線型高分子，結(jié)構(gòu)簡單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種惰性的具有生物相容性的物質(zhì)。由于空間效應(yīng)， PEG 表面排斥其它分子[12]。進(jìn)入的分子不能被吸附，如靜電力和不能穿透含水的PEG層，導(dǎo)致惰性親水表面缺少“粘性”。PEG作為洗滌劑可防止非特異性酶(如HRP)與其表面結(jié)合[13]。

固定聯(lián)合過程首先要用乙醇和蒸餾水仔細(xì)清洗傳感器內(nèi)腔。之后，將1 mg的PEG/聚乙烯醇(PVA)溶解到1 mL蒸餾水中。PEG在水中可直接溶解，但PVA要溶解到熱水中。溶液在常溫下放到洗過的傳感器腔內(nèi)培養(yǎng)1 h。沖洗PEG/PVA，用2%三乙胺和2%11-TESU溶液進(jìn)行鹽化作用。首先分別溶解1 mL三乙胺到45 mL蒸餾水中、溶解1.1 mL 11-TESU到48.9 mL乙醇中。然后將這2種溶液按1∶1充分混合，室溫下在系統(tǒng)中培養(yǎng)1 h。此前，系統(tǒng)用乙醇清洗過，并在電爐中80 ℃下加熱2 h。在此期間，將1 mg HRP、1 mg GOX和1 mg硼氫化鈉溶解在10 mL的聚丁二酸丁二醇酯中。最后將準(zhǔn)備好的溶液在系統(tǒng)中培養(yǎng)1 h。

2.3.2在微珠上進(jìn)行外部的固定聯(lián)合

外部固定聯(lián)合方法是將HRP和GOX共價(jià)固定在功能化的二氧化硅微珠表面。HRP和GOX首先被固定，然后微珠注入到微珠充填腔。

外部固定聯(lián)合首先將1.5 g二氧化硅微珠與10 mL 2.5%的戊二醛溶液混合并在室溫下振蕩90 min，然后加入2 倍的水混合充分。再用離心機(jī)全速分離10 min。丟棄懸浮層，重復(fù)進(jìn)行3次。同時(shí)制備酶溶液，溶解10個(gè)單位的HRP和10個(gè)單位的GOX到0.1 mol·L-1的聚丁二酸丁二醇酯中。外部的固定聯(lián)合通過將酶溶液加到預(yù)先制備好的微珠并且在室溫下培養(yǎng)1 h完成。溶液4 ℃下保存，備用。

微珠表面的外部固定聯(lián)合比內(nèi)部固定聯(lián)合方法更有優(yōu)勢。相對(duì)體積來說，比表面積的高增長使得大量的酶在微珠表面固定聯(lián)合，尤其是在酶與被分析物的交互區(qū)固定聯(lián)合。這樣能使腔室內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)在數(shù)量和比率上具有很好的效果。除此之外，由于使用了戊二醛的解決方案，外部的固定聯(lián)合可提供強(qiáng)大的附著在微珠表面的共價(jià)酶。

2.4傳感器的設(shè)計(jì)

光學(xué)生物傳感器通過硅橡膠軟印法進(jìn)行微制備，由玻璃基底和生物傳感器主體組成。

內(nèi)部生物傳感器主體由傳感器腔、流體入口、出口、分配以及光纖通道組成(圖1)。傳感器主體包括入口和出口通道，作用是使流體在傳感器內(nèi)部流動(dòng)。流體分流通道的設(shè)計(jì)目的是使流體能夠均勻分布于傳感器腔室。光纖通道垂直布置在傳感器腔室，這些通道設(shè)計(jì)成扣件的形式，目的是在通道上更好地固定光纖，這些通道末端是兩面凹的鏡頭，借此光可以被集中，然后通過感受神經(jīng)纖維輸送結(jié)果。

外部生物傳感器主體是由傳感器腔、微珠腔、流體入口、出口和光纖通道組成(圖2)。微珠腔設(shè)計(jì)在入口側(cè)面，傳感器室和狹窄的網(wǎng)格接壤。固定化的微珠通過一個(gè)單獨(dú)的微珠充填通道連接到微珠腔，直接插入固定化的微珠。光纖通道垂直布置在傳感器腔的兩側(cè)，末端是兩面凹的微透鏡。扣件型設(shè)計(jì)可以使光纖更平穩(wěn)地進(jìn)入通道，兩面凹的微透鏡可以調(diào)整光纖的數(shù)值孔徑。

圖1　內(nèi)部生物傳感器的結(jié)構(gòu)

圖2　外部生物傳感器的結(jié)構(gòu)

3結(jié)果與討論

3.1測量裝置

光子生物傳感器表征實(shí)驗(yàn)通過2個(gè)直徑為230 μm的多模光纖(光學(xué)元件，達(dá)豪，德國)、一個(gè)單色光源(S1FC635，光學(xué)元件)、一個(gè)分光儀進(jìn)行。2個(gè)光纖首次插入到硅橡膠自調(diào)整光纖通道，一個(gè)連接光源，另一個(gè)連接分光器。因此，光-被分析物交互作用的光程與反應(yīng)堆的寬度相同。如果被分析物在介質(zhì)中被稀釋并且沒有二次發(fā)射的光子，這個(gè)光子生物傳感器的性能遵循比爾-朗伯定律——吸光度與光程、濃度和摩爾吸收率成正比。

3.2測試結(jié)果

在研究中，內(nèi)部和外部固定傳感器設(shè)計(jì)已經(jīng)通過測試。對(duì)于內(nèi)部固定設(shè)計(jì)，檢查程序：簡單的化學(xué)吸附法和PEG/PVA。

直接固定酶在硅橡膠表面，并用聚丁二酸丁二醇酯清洗系統(tǒng)，檢測簡單的化學(xué)吸附法。吸光度的測量以TMB作為媒介，在過氧化氫減少的情況下，該媒介變?yōu)榫G色。顏色的變化程度取決于光吸收，因此可提供關(guān)于葡萄糖濃度的信息。實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖以33 μL·h-1流速不斷被注入，在固定時(shí)間間隔內(nèi)記錄結(jié)果。結(jié)果表明，光學(xué)吸收測量結(jié)果波動(dòng)很大，并且未獲得有效的測量值。這可能與缺少表面預(yù)處理而導(dǎo)致的表面酶綁定不確定有關(guān)。

因此，第二個(gè)方法先使用鹽化作用，然后采用PEG進(jìn)行檢測。執(zhí)行與之前相同的檢測程序。繪制吸光度與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度和葡萄糖濃度線性擬合良好，傳感器能夠檢測濃度為0.26～5.00 mg·L-1的葡萄糖，R2=0.9905。即表面修正和鹽化步驟是有效的，提高了傳感器的性能。

圖3　葡萄糖吸光度校準(zhǔn)曲線(15 min)

然而大量固定的酶是受限的，影響生物傳感器檢測范圍。為了解決這一問題，改進(jìn)了光子生物傳感器，并對(duì)玻璃粉腔進(jìn)行測試。首先，充填通道玻璃粉腔被固定的微珠顆粒填滿，然后開始通道封閉檢測過程，使用同樣的測量方法。繪制吸光度與葡萄糖濃度的關(guān)系曲線(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度與葡萄糖濃度線性擬合良好，傳感器能夠檢測濃度為0.7～10.0 mg·L-1的葡萄糖，R2=0.9845。

圖4　葡萄糖吸光度校準(zhǔn)曲線(10 min)

外部固定傳感器與內(nèi)部設(shè)計(jì)相比提供了一個(gè)較寬的濃度測量范圍，平均能獲得多于一個(gè)的光譜。這個(gè)和高增長的固定比表面積有關(guān)，增加了固定在玻璃粉上的酶與被反應(yīng)物之間的反應(yīng)區(qū)域。表明，外部固定設(shè)計(jì)使用簡單，是一種有效的固定方法。此外，外部固定方法可以簡單地使不止一種酶固定在玻璃粉表面，不同的基底都可以被檢測。從獲得的光子結(jié)果推斷，使用戊二醛作為外部固定酶到玻璃粉的交聯(lián)劑，可以提高捆綁酶到玻璃粉的強(qiáng)度，對(duì)于增強(qiáng)基底的活性與特異性有著積極的影響。這與構(gòu)造的維護(hù)保養(yǎng)、酶的活性部位和酶在固定步驟中非常細(xì)微的改變有關(guān)。

在傳感器的設(shè)計(jì)過程中，使用固化方法對(duì)生物傳感器的敏感性和性能都會(huì)產(chǎn)生較大的影響。

4結(jié)論

提出了2種在持續(xù)流動(dòng)條件下基于內(nèi)部與外部固定聯(lián)合的葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過氧化物酶(HRP)的光子葡萄糖生物傳感器設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，內(nèi)部光子生物傳感器設(shè)計(jì)可檢測濃度為0.26～5.00 mg·L-1的葡萄糖，相關(guān)系數(shù)為0.9905；通過外部固定聯(lián)合方法能夠固定大量的酶共價(jià)于玻璃粉，加快了傳感器腔內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的速率，在連續(xù)流動(dòng)情況下，可檢測濃度為0.7～10.0 mg·L-1的葡萄糖，相關(guān)系數(shù)為0.9845。該傳感器在光子芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的在線分析方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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A Kind of Embedded Optical Biosensor Used to Monitor Glucose Concentration

DING Tao1,WANG Fang2

(1.ShaanxiKeyLaboratoryofChemicalReactionEngineering,Yan′anUniversity,Yan′an716000,China；2.SchoolofPetroleum,Yan′anUniversity,Yan′an716000,China)

Abstract：Since it is difficult for continuously monitoring blood sugar in a steady flow,two silicon rubber (PDMS) photonic biosensors were proposed in this paper.One is an internal fixed sensor and the other is a modified version of this sensor,i.e.,the beads cavity with glass powder filling composite in the sensor channels.Results showed that，the internal fixed sensor could detect glucose in the concentrations region of 0.26～5.00 mg·L(-1) with R2 of 0.9905.The external immobilization method offered the possibility of covalently immobilizing huge amount of enzymes to micro-beads,which promoted the rate of chemical reaction taking place inside the biosensor cavity.External fixed sensor could detect glucose in the concentrations region of 0.7～10.0 mg·L(-1) with R2 of 0.9845 under a continuous flow.The results have a good application prospect in photon system online analysis.

Keywords：glucose;enzyme;micro-bead;biosensor

中圖分類號(hào)：O 657.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)03-0063-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.017

收稿日期：2015-11-07

作者簡介：丁濤(1982-)，男，陜西渭南人，講師，研究方向：微傳感器設(shè)計(jì)，E-mail:dtguokong2013@163.com。

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)(15JK1808)