孫曉東， 閻　偉， 李朝緒， 劉　麗， 覃偉權(quán)*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；

2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

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蘇云金芽胞桿菌的鑒定及對椰子織蛾的致死作用

孫曉東1，2， 閻偉1， 李朝緒1， 劉麗1， 覃偉權(quán)1*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339；

2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

摘要:【背景】利用采集到的樣品分離出蘇云金芽胞桿菌菌株，針對椰子織蛾幼蟲進(jìn)行室內(nèi)生物活性測定，以期獲得對椰子織蛾幼蟲具有高毒力菌株，并為椰子織蛾的生物防控提供理論和技術(shù)依據(jù)，同時(shí)為轉(zhuǎn)Bt基因作物提供新的基因資源?！痉椒ā吭诤Ｄ蠉u椰子織蛾潛在分布區(qū)采集樣品，利用溫度法篩選蘇云金芽胞桿菌并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，采用浸葉法進(jìn)行Bt菌株對椰子織蛾幼蟲的生物活性測定。【結(jié)果】海南省保亭縣土壤樣品中篩選出8株菌株，電子顯微鏡下觀察到該批菌株含有菱形、球形、方形晶體；通過分子生物學(xué)鑒定明確了6株菌株含有cry基因，2株沒有鑒定出cry基因；利用相同濃度菌懸液對椰子織蛾幼蟲進(jìn)行了生物活性測定，結(jié)果表明，50 μg·mL(-1)的BAT10菌株殺蟲晶體蛋白對椰子織蛾幼蟲的致死率達(dá)100%，同樣濃度的29-15-4與BAT20菌株殺蟲晶體蛋白對椰子織蛾幼蟲的致死率超過80%，其余5株Bt的殺蟲晶體蛋白致死率較低，致死率小于50%?！窘Y(jié)論與意義】本試驗(yàn)篩選出1株高毒力菌株和2株效果較好的Bt菌株，可應(yīng)用于椰子織蛾的生物防控。

關(guān)鍵詞:Bt； 椰子織蛾； 鑒定； 生物活性

椰子織蛾OpisinaarenosellaWalker屬鱗翅目Lepidoptera織蛾科Qecophoridae,英文名coconut black-headed caterpillar，又稱椰子木蛾、黑頭履帶蟲、椰柱蛾、食葉履帶蟲等，主要分布于斯里蘭卡、印度孟加拉、緬甸、印度尼西亞、巴基斯坦、泰國、馬來西亞等地(武懷恒等，2014; Venkatesanetal.，2009)。椰子織蛾幼蟲取食葉片，嚴(yán)重時(shí)入侵啃食整個(gè)樹冠，導(dǎo)致植株發(fā)育緩慢，果實(shí)產(chǎn)量大幅減少。對椰子織蛾進(jìn)行有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析，結(jié)果顯示，其屬于高風(fēng)險(xiǎn)有害生物，在我國多地易定殖(閻偉等，2013)，對我國的椰子、檳榔、蒲葵、中東海棗、大王棕等棕櫚作物(劉向蕊等，2014a)威脅很大，在我國具有嚴(yán)重的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)危害性。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一種目前世界上應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑，由于其高效、低毒、安全、經(jīng)濟(jì)，是最具發(fā)展?jié)摿Φ奈⑸餁⑾x劑。目前已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)Bt菌株均能產(chǎn)生多種類型的晶體蛋白，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物等具有特異性的殺蟲活性(蔡吉林等，2013)。Bt作為生防菌中最重要的一種，在使用上有著靶標(biāo)性強(qiáng)、對人類和牲畜不會(huì)造成毒害以及環(huán)境友好型的特點(diǎn)，但是由于轉(zhuǎn)Bt基因作物在全球的推廣與種植，使很多靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生了不同程度的抗性(崔樹松等，2013； Gassmannetal.,2014)。

目前，針對椰子織蛾的生態(tài)學(xué)(劉向蕊等，2014b)、生物學(xué)鑒定(李后魂等，2014)、化學(xué)防控(Shivashankaretal.，2000)、天敵寄生蜂防控(Venkatesanetal.，2003)等相關(guān)方面已有研究，尚未見到利用Bt防控椰子織蛾的相關(guān)研究與報(bào)道。本文利用在椰子織蛾入侵風(fēng)險(xiǎn)區(qū)采集的樣品并分離出的Bt菌株針對椰子織蛾幼蟲進(jìn)行室內(nèi)生物活性測定，以期獲得對椰子織蛾幼蟲具有高毒力的菌株，為椰子織蛾的生物防控提供理論和技術(shù)依據(jù)，同時(shí)為轉(zhuǎn)Bt基因作物提供新的基因資源。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基LB固體與液體培養(yǎng)基、1/2 LB固體與液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制方法參見Sambrooketal.(1989)。

1.1.2菌株8株Bt菌株分離自海南省保亭縣土壤樣品，菌株HD73為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所贈(zèng)送。

1.1.3引物序列參見表1。

表1　鑒定引物及序列

1.1.4主要試劑Taq酶、限制性內(nèi)切酶、PMD19-T載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞、凝膠回收試劑盒均購自Takara公司；Byeotime公司的BAC蛋白濃度定量試劑盒(增強(qiáng)型)。

1.2方法

1.2.1Bt掃描電鏡樣品的制備分離純化的Bt菌株在1/2 LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，置30 ℃下培養(yǎng)48 h，在無菌工作臺(tái)上刮取少許菌苔，純水清洗后再加入適當(dāng)純水充分懸浮，將砸碎的細(xì)小碎片浸潤在懸浮液中2 min后取出，低溫冷凍干燥后備用。

1.2.2Bt質(zhì)粒的提取與鑒定分離純化后的Bt菌株在液體LB中(230 r·min-1、30 ℃) 培養(yǎng)12 h ，采用Narvaetal.(1991)的方法提取質(zhì)粒。采用PCR-RFLP方法鑒定殺蟲晶體蛋白基因，提取Bt菌株的質(zhì)粒DNA進(jìn)行cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10類基因的PCR-RFLP鑒定，鑒定引物參見表1，鑒定方法參見宋福平等(1998)及蘇旭東(2005)。

1.2.3Bt菌懸液所含蛋白的定量先接種1/2 LB固體培養(yǎng)基至菌體裂解(30 ℃恒溫，48 h)；無菌操作刮取菌體，然后使用滅菌去離子水制備成菌懸浮液，使用Byeotime BAC蛋白濃度定量試劑盒(增強(qiáng)型)進(jìn)行菌懸浮液的蛋白濃度定量。

1.2.4cry基因的克隆使用凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并純化，純化后的產(chǎn)物按照目的片段與pMD19-T載體1∶3的比例16 ℃連接3 h，取10 μL連接產(chǎn)物加入到100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，具體轉(zhuǎn)化方法參見束長龍等(2007)。轉(zhuǎn)化完成后挑取陽性克隆在上海生工公司進(jìn)行核酸測序。

1.2.5殺蟲活性測定采用浸葉法(劉楠等，2010)。椰子織蛾幼蟲為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，BAT-10的蛋白溶液設(shè)置為40 μg·mL-1。將椰子葉片用清水洗凈晾干，選取鮮嫩一致的葉片切成15 cm的段狀，在各個(gè)濃度的混合均勻的蛋白溶液(含0.1%吐溫-80)中浸泡5 min，晾干，放入生測瓶中，每瓶接4齡幼蟲30頭，每個(gè)處理重復(fù)3次，28 ℃生化培養(yǎng)箱中保溫，培養(yǎng)72 h后調(diào)查死、活蟲數(shù)，并觀察幼蟲取食情況。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離與形態(tài)鑒定

菌株在1/2 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后形成單菌落，菌落乳白色，圓形或近圓形，邊緣整齊，菌落中間較厚，向四周逐漸變薄。掃描電鏡下觀察到菌株菌體為長桿狀，芽孢為長圓棒狀，晶體有菱形、球形、方形等形狀(圖1)，其中菌株BAT10、BAT20、1-11、BAT7、BAT17、8-12的伴孢晶體為菱形，29-15-4晶體為球形，BAT35晶體為菱形和方形，初步鑒定為蘇云金芽胞桿菌。

圖1　Bt菌株的掃描電鏡圖片

2.2分子水平的鑒定

分別提取Bt菌株的質(zhì)粒DNA并以表1中cry基因鑒定引物進(jìn)行cry基因的鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒(Takara)純化后連接T載體(Takara)進(jìn)行克隆，挑取陽性單克隆送樣上海生工進(jìn)行測序，具體結(jié)果見表2，其中6株含有cry基因，2株沒有鑒定出已知基因型。結(jié)果表明，BAT10、BAT20、1-11、BAT7、BAT17同時(shí)含有cry1、cry1I、cry2類的基因；菌株29-15-4只含有cry8類的基因；BAT35和8-12未鑒定出已知基因型。菌株基因型的多樣性與土壤狀況、樣品海拔無明顯規(guī)律性。

2.3Bt菌株對椰子織蛾的毒力

生物測定結(jié)果顯示，8株菌株對椰子織蛾4齡幼蟲具有一定的殺蟲活性，具體結(jié)果見表3。其中,菌株BAT10對椰子織蛾幼蟲的校正致死率達(dá)100%，與對照及其他菌株有顯著差異，殺蟲效果最顯著；菌株BAT20與菌株29-15-4校正致死率為80%～90%，2株菌株間差異不顯著，殺蟲效果較顯著；8-12、BAT7、BAT35、BAT17、1-11校正致死率低于50%，殺蟲效果不顯著。

表2　Bt菌株cry基因型鑒定

(+)陽性對照：蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株HD73。

(+) Positive control:B.thuringiensissubsp.kurstakiHD73.

表3　Bt菌株對椰子織蛾的殺蟲活性(72 h )

不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

Letters denote significant differences among strains (P<0.05).

3討論

本文采用PCR-RFLP法對8株菌株進(jìn)行了cry基因鑒定，但是有2株未鑒定出cry基因，不過在光學(xué)顯微鏡下可以確定其產(chǎn)生晶體，推測原因可能是菌株含有的cry基因的序列比較新，現(xiàn)有的鑒定引物尚不能發(fā)現(xiàn)其基因型，因此需要通過更多的克隆方法來明確其菌株內(nèi)的基因型。

迄今為止，我國對蘇云金芽胞桿菌的研究主要針對農(nóng)業(yè)害蟲，如倪萬潮等(1998)在20世紀(jì)90年代研發(fā)并推廣的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉，可用來防控農(nóng)業(yè)害蟲棉鈴蟲，朱勛等(2011)發(fā)現(xiàn)了對小菜蛾高毒力的Bt菌株。另外，Bt在大田應(yīng)用方面也取得了良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益，而在林業(yè)害蟲的防治和研究方面相對緩慢，將Bt菌株應(yīng)用到防治林業(yè)害蟲椰子織蛾的研究還未見相關(guān)報(bào)道，離市場化還有很大的差距。

本試驗(yàn)通過Bt菌株對椰子織蛾幼蟲的生物活性測定篩選出1株高毒力菌株和2株效果較好的Bt菌株，下一步將把這幾株菌株進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)并研發(fā)Bt粉劑與油劑，在進(jìn)行科學(xué)的田間試驗(yàn)后逐步推向市場，這將會(huì)大大提高我國對椰子織蛾的防控效果，促進(jìn)林業(yè)害蟲的生物防治技術(shù)的穩(wěn)步發(fā)展。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

Identification ofBacillusthuringiensisand insect activity against

OpisinaarenosellaWalker

Xiao-dong SUN1,2, Wei YAN1, Chao-xu LI1, Li LIU1, Wei-quan QIN1*

1CoconutResearchInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Wenchang,Hainan571339,China；2CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang150030,China

Abstract:【Background】 The biological activity of Bacillus thuringiensis (Bt) strains collected from soil samples was tested against Opisina arenosella Walker, in order to obtain high insect activity strains that may help control the species. The second objective of this study was to provide new genetic resources for transgenic plant of Bt that could be more resistant to this species. 【Method】 Soil samples were collected from different areas of Hainan Province potentially suitable for O. arenosella. The temperature screening method was used to isolate Bt strains, which were then identified based on their morphology and molecular biology. The toxicity of Bt strains to larvae of O. arenosella was tested by leaf immersion bioassay method. 【Result】 Eight Bt isolates were obtained from Baoting soil samples, Hainan Province. The 8 Bt isolates included bipyramidal crystal, spherical crystal, square crystal types. PCR-RFLP analysis showed that Cry1, cry1I and cry2 type genes were present in these isolates, but the cry gene-types of two isolates were unknown. The toxicity of the extracted insecticidal crystal proteins (ICP) of the 8 strains against larvae of O. arenosella was assayed. The results indicated that the use of ICP of BAT10 (50 μg·mL(-1)) resulted in 100% mortality of the larvae. ICP of 29-15-4 and BAT20 resulted in more than 80% mortality while the ICP of the other five strains showed less than 50% mortality. 【Conclusion and significance】 This study showed that effective Bt strains could be found in soil potentially suitable to O. arenosella and among them, two strains had the potential to be used as biological control against this species.

Key words:Bacillus thuringiensis； Opisina arenosella Walker; identification； bioactivity

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.01.011

作者簡介:孫曉東， 男， 博士研究生， 助理研究員。 研究方向： 棕櫚植物病蟲害防治。 E-mail: sxd1949@163.com.*通訊作者Corresponding author, E-mail: qwq268@163.com

基金項(xiàng)目:海南省重大項(xiàng)目(ZDZX2013008)； 海南省重點(diǎn)項(xiàng)目(ZDXM20130049、ZDXM20130004)； 海南省基金(311091)； 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(1630041014002)

收稿日期(Received)： 2015-05-09接受日期(Accepted)： 2015-06-21