施　泉，陳曉沛，林新春，徐永漢，徐英武（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

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雷竹和擬南芥SOC1多聚體差異性分析

施泉，陳曉沛，林新春，徐永漢，徐英武
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

摘要：MADS-box是一個(gè)超家族基因，可通過形成多聚體復(fù)合物實(shí)現(xiàn)對花發(fā)育的調(diào)控。其中SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）作為MADS-box家族的重要成員，對花形成時(shí)間起決定作用。作為轉(zhuǎn)錄因子蛋白，SOC1包含MADS，I，K和C 4個(gè)獨(dú)特功能的結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮功能的過程中，其中K結(jié)構(gòu)域能夠調(diào)控同源或是異源蛋白多聚體的形成，I結(jié)構(gòu)域能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的作用。在單子葉植物雷竹Phyllostachys violascens和擬南芥Arabidopsis thaliana中，開花時(shí)間模式上存在明顯差異，前者開花時(shí)間不確定，后者是確定的。盡管不能直接推斷這種現(xiàn)象與SOC1形成植物不同復(fù)合物相關(guān)聯(lián)，但雷竹和擬南芥SOC1是否具有形成相同模式的復(fù)合物對于竹類植物開花時(shí)間的研究具有重要意義。以雷竹和擬南芥SOC1作為研究對象，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)分析SOC1在形成多聚體模式方面的差異性。結(jié)果表明：擬南芥SOC1能形成同源二聚體，并且可通過結(jié)構(gòu)域是I和K區(qū)形成同源多聚體；而雷竹SOC1不能形成多聚體，但可以通過K結(jié)構(gòu)域形成同源二聚體。因此，I結(jié)構(gòu)域可能是引起擬南芥和雷竹SOC1多聚體狀態(tài)不同的一個(gè)原因，這個(gè)結(jié)構(gòu)域是否對開花定時(shí)起決定作用還有待進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。圖5表2參29

關(guān)鍵詞：植物學(xué)；MADS-box；SOC1；雷竹；擬南芥；酵母雙雜交；多聚體狀態(tài)；I和K結(jié)構(gòu)域

植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的過程中，花的發(fā)育是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，由一系列外部環(huán)境和內(nèi)部因子決定［1-2］。大多數(shù)MADS-box基因參與花發(fā)育的不同階段，相互之間可形成復(fù)雜的復(fù)合物并構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，控制花發(fā)育的整個(gè)過程［2-4］。SOC1基因作為MADS-box家族中的一員，能夠整合自主途徑、春化途徑、光周期途徑和赤霉素途徑中的信號分子，作用于下游特異性基因，進(jìn)而調(diào)控花期［2, 5］。在光周期途徑中，SOC1不僅受CO的調(diào)控，同時(shí)SOC1還反饋?zhàn)饔糜贑O。實(shí)驗(yàn)表明CO的過量表達(dá)能夠促進(jìn)下游基因SOC1的表達(dá)，此外功能缺失的SOC1可以通過CO轉(zhuǎn)基因植株而提前開花［6-9］。SOC1基因的活化同時(shí)受到開花素蛋白FT的調(diào)控，另外在調(diào)控開花時(shí)，F(xiàn)T和FD的共同作用可以提高SOC1基因的表達(dá)［10-11］。SOC1編碼的蛋白屬于MIKC型轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域中MADS盒子能夠與特異性的DNA結(jié)合形成復(fù)合物［12-13］，并且與其他蛋白相互作用調(diào)控靶基因的表達(dá)［14］。SOC1的C末端屬于保守的motif結(jié)構(gòu)域［14-15］，且能夠調(diào)整MADS結(jié)構(gòu)域的相互作用，穩(wěn)定或增強(qiáng)K結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的相互作用［16］。植物開花過程中，SOC1不僅能夠與AGL24形成異源二聚體，整合開花信號來促進(jìn)開花［16-17］，還能夠作為赤霉素（GA）的靶基因調(diào)控開花［1, 18-19］。植物開花具有多樣性特征，如木本植物雷竹Phyllostachys violascens，開花時(shí)間不確定，通常零星開花，且開花類型復(fù)雜多樣，花序?yàn)榧倩ㄐ颍Y(jié)實(shí)率低［20］。草本植物擬南芥Arabidopsis thaliana開花時(shí)間和形態(tài)具有確定性。雷竹和擬南芥開花時(shí)間特征明顯不同，開花整合因子SOC1在這2種植物中均已被發(fā)現(xiàn)［21］，并且PvSOC1在雷竹開花過程中的作用做了初步研究。作為研究SOC1對開花時(shí)間多樣性作用的開始，這里我們分析雷竹和擬南芥SOC1在多聚體形成方面是否存在差異。研究采用同源克隆的方法，分別獲得成花開關(guān)基因PvSOC1［21］和AtSOC1，同時(shí)構(gòu)建2個(gè)基因全長的酵母雙雜交載體，利用酵母雙雜交方法，分析形成同源聚集狀態(tài)的差異。通過構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交載體，確定引起多聚體差異性對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域。這一研究結(jié)果，對于理解SOC1基因在雷竹和擬南芥定時(shí)開花過程中的特異性作用，提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

研究所用材料來自于實(shí)驗(yàn)室大棚內(nèi)的已開花雷竹和溫室內(nèi)栽植的哥倫比亞野生型擬南芥。AtSOC1在開花的野生型擬南芥花、莖、葉中均有表達(dá)［4］，故分別采取開花雷竹和擬南芥的莖、葉、花等不同組織，用液氮速凍保存，實(shí)驗(yàn)材料放置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA的提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄

將不同組織部位的樣品等比例混合，用液氮磨碎，根據(jù)總核糖核酸（RNA）提取法（Trizol法）提取植物組織混合樣品RNA，以10.0 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測；采用PrimeScriptTM進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的cDNA用于基因的克隆。

1.3PvSOC1和AtSOC1的基因克隆

根據(jù)美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）中已知的擬南芥AtSOC1序列和實(shí)驗(yàn)室得到的雷竹PvSOC1序列，設(shè)計(jì)引物（表1），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，10×PCR緩沖液3.0 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）3.0 μL，上下游引物各1.5 μL，去離子水補(bǔ)足30.0 μL。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的擴(kuò)增，膠回收目的片段，純化后的產(chǎn)物連接到pMD-19（simple）載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α藍(lán)白斑篩選，PCR驗(yàn)證，提取質(zhì)粒送往生物公司測序。

1.4PvSOC1和AtSOC1氨基酸序列分析

采用BioEidt軟件對PvSOC1-like基因序列進(jìn)行翻譯，NCBI中進(jìn)行氨基酸序列對比，結(jié)合DANman軟件，進(jìn)行PvSOC1-IKC（缺少M(fèi)ADS結(jié)構(gòu)域部分）氨基酸序列同源性分析。

1.5PvSOC1和AtSOC1自激活活性檢測

采用特異性引物（表1），構(gòu)建SOC1酵母雙雜交載體，雙酶切產(chǎn)物分別連入pGADT7（AD-Active domain）和pGBKT7（BD-Binding domain）載體中去，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性單克隆提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證序列正確性，LiAc轉(zhuǎn)化法將AD和BD重組載體分別轉(zhuǎn)入Y187和AH109感受態(tài)細(xì)胞中，分別涂布在缺少亮氨酸和色氨酸（SD/-Leu和SD/-Trp）的培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單克隆活化培養(yǎng)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽性單克隆采用點(diǎn)滴法在含有X-a-Gal的缺陷培養(yǎng)皿上進(jìn)行自激活活性檢測，其中AD和BD載體為陰性對照，PcL為陽性對照。30℃培養(yǎng)，觀察菌斑顯色情況。

表1　實(shí)驗(yàn)過程中所用的引物Table 1 Primer sequences used in experiment

1.6PvSOC1和AtSOC1多聚體分析檢測

經(jīng)過驗(yàn)證的陽性單克隆菌液AD-PvSOC1/AtSOC1（或BD-PvSOC1/AtSOC1）分別與BD-PvSOC1/AtSOC1（AD-PvSOC1/AtSOC1），BD（AD）空載雜交，分別吸取10.0 μL的菌液，600.0 μL的完全培養(yǎng)劑（YPDA）液體過夜培養(yǎng)，100.0 μL培養(yǎng)液涂布在同時(shí)缺少亮氨酸和色氨酸（SD/-Leu-Trp）的培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)3～5 d，挑取單克隆在液體培養(yǎng)基SD/-Leu-Trp中培養(yǎng)，吸取10.0 μL培養(yǎng)液，點(diǎn)滴在含有X-a-Gal的4缺（SD/-Leu-Trp-Ade-His）固體培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，觀察是否顯色，如果單克隆變藍(lán)證明發(fā)生相互作用形成二聚體結(jié)構(gòu)。

1.7PvSOC1和AtSOC1不同結(jié)構(gòu)域載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞

將PvSOC1和AtSOC1分成M，I，K和C 4個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建包括M，MIK，KC和C不同結(jié)構(gòu)域的酵母雙雜交載體，設(shè)計(jì)引物（表1），純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后分別連入AD和BD載體中去，轉(zhuǎn)入DH5α，菌液檢測陽性克隆，提取質(zhì)粒。采用LiAc轉(zhuǎn)化法，PEG3350/DMSO制備感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)入酵母宿主中去，在相應(yīng)的缺陷培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，挑取單克隆驗(yàn)證插入片段的大小。

1.8結(jié)構(gòu)域重組體自激活活性檢測和多聚體分析

將不同結(jié)構(gòu)域酵母雙雜載體雜交培養(yǎng)，在SD/-Leu-Trp培養(yǎng)皿上篩選雜合體，并在含有X-a-Gal的SD/-Leu-Trp缺培養(yǎng)皿上進(jìn)行顯色反應(yīng)。為進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將SD/-Leu-Trp缺培養(yǎng)皿上挑選出來的單克隆并在SD/-Leu-Trp+X-a-Gal培養(yǎng)皿上進(jìn)行生長狀態(tài)的培養(yǎng)，觀察酵母的生長狀態(tài)。

2　結(jié)果與分析

2.1PvSOC1和AtSOC1目的片段的結(jié)構(gòu)域分析

部分結(jié)構(gòu)域同源性分析結(jié)果表明：雷竹和其他SOC1基因序列存在差異性的部位主要集中在I和C結(jié)構(gòu)域。不同的植物中I結(jié)構(gòu)域差異性極大，大約有10～20個(gè)氨基酸組成。另外，C結(jié)構(gòu)域氨基酸保守性較差，多疏水氨基酸結(jié)構(gòu)。I和C結(jié)構(gòu)域之間具有相對保守性的K結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1　結(jié)構(gòu)域示意圖和不同植物SOC1局部氨基酸序列對比Figure 1 Structural diagrams and amino acid sequence alignment

2.2全長PvSOC1和AtSOC1自激活和多聚體分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可表明：雷竹PvSOC1和擬南芥AtSOC1都不存在自激活活性（圖2A）。酵母雙雜交多聚體分析結(jié)果表明：雷竹PvSOC1蛋白自身不存在相互作用，而AtSOC1易形成二聚體現(xiàn)象，自身相互作用（圖2B和圖2C）。

圖2　PvSOC1和AtSOC1自激活檢測和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)Figure 2 Analysis of transcriptional activation and polymerization for PvSOC1 and AtSOC1

2.3雷竹PvSOC1不同結(jié)構(gòu)域雙雜交分析

PvSOC1基因不同結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)可知：AD/BD-M/MIK/KC/C不存在自激活活性現(xiàn)象（圖3B），不同結(jié)構(gòu)域雙雜實(shí)驗(yàn)可知PvSOC1中的KC結(jié)構(gòu)域存在二聚體現(xiàn)象，自身相互作用；M，MIK和C結(jié)構(gòu)域蛋白沒有相互作用，圖3C為陽性與陰性對照組（圖3）。

圖3　PvSOC1和AtSOC1不同結(jié)構(gòu)域蛋白酵母轉(zhuǎn)錄激活檢測Figure 3 Yeast two hybrid system to detect the transcriptional activation among different domains in PvSOC1 and AtSOC1, respectively

圖4　PvSOC1不同結(jié)構(gòu)域蛋白酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)多聚體分析Figure 4 Yeast-two hybrid assays to analyze the domain polymerization in PvSOC1

2.4擬南芥AtSOC1不同結(jié)構(gòu)域雙雜交分析

AtSOC1酵母雙雜交不同結(jié)構(gòu)域?qū)嶒?yàn)顯示：結(jié)構(gòu)域之間不存在自身活性現(xiàn)象（圖3A）；盡管實(shí)驗(yàn)中AtSOC1全長存在相互作用，能形成同源多聚體，但是單獨(dú)的M和C結(jié)構(gòu)域沒有同樣的多聚體現(xiàn)象發(fā)生；KC結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生相互作用，在有I存在的MIK結(jié)構(gòu)域蛋白可以形成多聚體狀態(tài)，發(fā)生相互作用（圖5）。

圖5　AtSOC1不同結(jié)構(gòu)域蛋白酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)多聚體分析Figure 5 Yeast-two hybrid assays to analyze the domain polymerization in AtSOC1

3　討論

本研究以單子葉木本植物雷竹和雙子葉草本植物擬南芥作為研究對象，針對PvSOC1和AtSOC1進(jìn)行研究。擬南芥在開花的過程中，AtSOC1起到主要的樞紐作用。AtSOC1通過和自己形成不同的多聚體或者與其他MADS-box轉(zhuǎn)錄因子形成蛋白復(fù)合物來調(diào)節(jié)上下游基因的蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控花期［17, 22-23］。通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)的證明，揭示了PvSOC1和AtSOC1的多聚體存在差異性。擬南芥中，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明：AtSOC1自身可發(fā)生相互作用，形成同源二聚體，這一結(jié)果與文獻(xiàn)［24］報(bào)道的一致；通過不同結(jié)構(gòu)域雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步可知：C末端缺失的MIK結(jié)構(gòu)域也能形成同源二聚體，KC結(jié)構(gòu)域不能發(fā)生相互作用。由此判定，AtSOC1主要功能部位的是I和K結(jié)構(gòu)域。另外，有研究發(fā)現(xiàn)K結(jié)構(gòu)域在MADS轉(zhuǎn)錄因子蛋白中相對保守。K結(jié)構(gòu)域包括3個(gè)疏水性的K1，K2和K3結(jié)構(gòu)域，這些疏水性的氨基酸不僅僅能夠協(xié)調(diào)自身同源二聚體的形成，還能夠促進(jìn)一些開花基因異源二聚體的形成。比如K結(jié)構(gòu)域中的某些疏水氨基酸可以促進(jìn)AP3和PI異源二聚體的形成從而調(diào)節(jié)花器官的發(fā)育［25］。同時(shí)K結(jié)構(gòu)域在植物進(jìn)化過程中也扮演著重要的角色。例如所有的MADS家族蛋白都能與特定的DNA相互結(jié)合形成同源或者異源二聚體［26］，或者與其他非MADS家族中的蛋白形成三聚體。但是，K結(jié)構(gòu)域的疏水特異性，更能夠促進(jìn)MADS家族內(nèi)部成員形成各種各樣復(fù)雜的高聚體，調(diào)節(jié)植物內(nèi)部生殖生長的需要［27-28］。

對雷竹PvSOC1進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：盡管PvSOC1不易形成同源二聚體，但是在MADS和C結(jié)構(gòu)域同時(shí)缺失的情況下，KC結(jié)構(gòu)域可以形成同源二聚體，結(jié)構(gòu)域K是主要的作用部位。雷竹PvSOC1和擬南芥AtSOC1酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：引起PvSOC1和AtSOC1多聚體差異性的原因主要在于I結(jié)構(gòu)域。I結(jié)構(gòu)域大約有20～30個(gè)氨基酸組成，這些氨基酸相對的不保守，但是有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)I結(jié)構(gòu)域不僅能夠幫助轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA，還能夠起到促進(jìn)自身二聚體形成的作用［7, 22, 29］。氨基酸序列對比進(jìn)一步表明，PvSOC1和AtSOC1中的I序列差異性極大，這種差異性有可能是PvSOC1和AtSOC1形成不同聚體狀態(tài)的一個(gè)主要原因。盡管如此，雷竹與擬南芥SOC1蛋白在形成多聚體模式上的差異性，是否與PvSOC1在調(diào)控雷竹花期過程中的特異功能相關(guān)聯(lián)，尚需通過轉(zhuǎn)基因功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2　PvSOC1和AtSOC1不同結(jié)構(gòu)域雙雜結(jié)果總結(jié)Table 2 Summary of the yeast two hybrid

4　參考文獻(xiàn)

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Oligomeric status of the SOC1 gene from Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana

SHI Quan, CHEN Xiaopei, LIN Xinchun, XU Yonghan, XU Yingwu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:MADS-box genes are a super family, which can form different polymers to mediate the development of floral primordia and floral organs.The important one of MADs-box genes, SOC1［suppressor of overexpression of cytochrome oxidase 1］, determine the flowering time.The MADS-box transcription factor, SOC1 contains four different functions domains: MADS, I, K, and C.The K domain controls the homologous or heterologous protein polymer formation.The I domain could stabilize the MADS-box proteins binding the DNA.In order to control the floral development, MADS-box proteins can form different complex.Visible difference in floral timing is demonstrated in Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana.A.thaliana is certain in floral timing while Phyllostachys violascens is not.Though we cannot compare the difference in floral timing with the difference in SOC1 complex formation, it is still interesting.MADS-box genes such as SOC1 containing four different functions: MADS, I, K and C, control floral timing.To determine whether SOC1’s from different species demonstrated similar patterns in forming a complex, this study analyzed the differences of polymer for-book=184,ebook=5mation for SOC1 that originated from Phyllostachys violascens and Arabidopsis thaliana using a yeast two-hybrid assay.Results of the assay showed that the full-length AtSOC1 gene from A.thaliana formed strong homopolymers with the I and K domains being the main regions for formation of the interaction.However, the fulllength SOC1 from Phyllostachys violascens（PvSOC1）did not form a homodimer.Thus, even though the K protein domain could form a homodimer, the presence of the I protein domain disrupted the dimer meaning the I domain could be a key factor in SOC1 polymer formation; the role of the I domain in floral timing should be verified with a plant transgene study.［Ch, 5 fig.2 tab.29 ref.］

Key words:botany; MADS-box; SOC1; Phyllostachys violascens; Arabidopsis thaliana; yeast two-hybrid; polymer; I and K protein domain

作者簡介：施泉，從事植物蛋白互作研究。E-mail：702431524@qq.com。通信作者：徐英武，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事蛋白和藥物結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究。E-mail：yxu@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270715，31000295）；浙江省林學(xué)一級重中之重學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（KF201304）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）項(xiàng)目（2012CB723008）；浙江農(nóng)林大學(xué)研究生創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（3122013240226）

收稿日期：2015-04-03；修回日期：2015-05-12

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.001

中圖分類號：S718.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0183-08