傅小萍，姚珊珊，王　瑩，郭　明（浙江農(nóng)林大學(xué)理學(xué)院，浙江臨安311300）

?

新型硅基固載材料的制備及固定化酶性能

傅小萍，姚珊珊，王瑩，郭明
（浙江農(nóng)林大學(xué)理學(xué)院，浙江臨安311300）

摘要：利用溶膠-凝膠原理，以正硅酸乙酯（TEOS）為原料，3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560）為偶聯(lián)劑，在酸性條件下發(fā)生縮合反應(yīng)制備新型基質(zhì)材料，通過紅外光譜（FT-IR），固體核磁共振波譜（CP/MAS(13)C NMR）和X-射線衍射（XRD）對(duì)基質(zhì)載體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過交聯(lián)-包埋固定化法制備新型纖維素固載酶，分析研究了固載酶及游離酶酶解不同微觀尺度纖維素基質(zhì)的酶學(xué)性能。結(jié)果表明：固載酶進(jìn)行酶促反應(yīng)的最優(yōu)pH 4.0，最優(yōu)溫度為60℃，表明固載酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶；測(cè)得固載酶的米氏常數(shù)與游離酶無顯著差異；固定化纖維素酶的重復(fù)使用性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性較游離酶均有較大改善。有關(guān)研究可為制備性能優(yōu)良的固載酶提供一定借鑒。圖9表2參20

關(guān)鍵詞：纖維素酶；交聯(lián)-包埋；固定化；催化性能

酶是一類具有高效催化能力的生物活性物質(zhì)，生命活動(dòng)中許多復(fù)雜而有規(guī)律的物質(zhì)和能量變化均離不開酶的催化作用。其中，纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，現(xiàn)已確定的主要組分為內(nèi)切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶和纖維二糖酶，它們協(xié)同作用，最終水解產(chǎn)物為葡萄糖。纖維素酶主要來源于細(xì)菌和放線菌等微生物，原生動(dòng)物、軟體動(dòng)物，昆蟲和植物的一些組織也能產(chǎn)生纖維素酶［1］。纖維素類物質(zhì)是地球上產(chǎn)量巨大卻又未得到充分利用的可再生資源。地球上植物光合作用可產(chǎn)生大于100億t·a-1的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素，合理利用纖維素可為社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)［2］。由于纖維素的充分利用與纖維素酶息息相關(guān)，使纖維素酶在生活中的許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，如織物整理［3］、蔬菜汁加工［4］、廢紙脫墨［5］等，可創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，但游離纖維素酶不易與底物分離，存在重復(fù)利用性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，大大增加了生產(chǎn)成本，因此，采用新技術(shù)新方法對(duì)纖維素酶進(jìn)行改性十分重要。其中人們?yōu)榱颂岣呃w維素酶的重復(fù)利用性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，常常制成各種固定化纖維素酶。酶的固定化是用物理或化學(xué)方法處理水溶性酶，使之不溶于水或固定于固相載體的一種技術(shù)，極大地拓寬了酶的應(yīng)用范圍，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。固載材料的制備是獲得性能優(yōu)越的固載酶的一個(gè)關(guān)鍵步驟。為了克服酶對(duì)熱、酸、堿等因素的不穩(wěn)定性，提高酶的催化活性，人們對(duì)酶的固定化進(jìn)行了廣泛深入的研究，制備出許多新的固定化材料［6-8］。相比較而言，無機(jī)載體比有機(jī)載體更耐生物降解，有更高的熱穩(wěn)定性且價(jià)格更低。本工作在前人研究的基礎(chǔ)上，分析比較現(xiàn)有固載材料和方法［9-10］，通過正硅酸乙酯（TEOS）的酸性水解產(chǎn)物和偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560）的縮合反應(yīng)合成新型基質(zhì)載體，并用紅外光譜分析固體核磁譜（13C NMR）分析和X-射線衍射分析對(duì)基質(zhì)載體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；通過交聯(lián)-包埋方法［11-12］制備新型纖維素固載酶，測(cè)定固載酶不同微觀尺度纖維素基質(zhì)的酶學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的纖維素固載酶除保持了酶的高效、專一、溫和及活性可調(diào)控等催化特性外，熱穩(wěn)定性也有較大幅度提高，并且具有易分離回收、可重復(fù)使用、儲(chǔ)存穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)實(shí)現(xiàn)纖維素酶的高效利用具有較好的借鑒意義。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

正硅酸乙酯（CP化學(xué)純，≥28.0%，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；乙醇（AR分析純，≥99.7%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸（AR分析純，≥99.5%，永華化學(xué)科技有限公司）；3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（97.0%，上海晶純生化科技股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CP化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；納米纖維素溶液（濕）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6 %，實(shí)驗(yàn)室自制）；纖維素酶（16.67×10-5kat· g-1，上海晶純生化科技股份有限公司）；3,5-二硝基水楊酸（CP化學(xué)純，≥98.0%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（AR分析純，≥96.0%，西隴化工股份有限公司）；酒石酸鉀鈉（AR分析純，≥99.0%，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（AR分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（AR分析純，99.0%，浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S型，中國(guó)鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A型，中國(guó)上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-C型，中國(guó)鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Zeta電位及粒度分析儀（90Plus Zeta型，美國(guó)Brookhaven公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（IR Prestige-21型，日本Shimadzu公司）；X-射線衍射儀（XRD-6000型，日本Shimadzu公司）；核磁共振波譜儀（AVANCE II 400MHz型，瑞士Bruker公司）；紫外可見分光光度計(jì)（T6系列型，中國(guó)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2硅基質(zhì)載體材料的合成［13-15］

25.0mL正硅酸乙酯（TEOS）溶解在50.0 mL乙醇中，40℃恒溫加熱攪拌5 min，加入50.0 mL水繼續(xù)攪拌10 min，加入乙酸調(diào)節(jié)酸堿度至pH 2～3，升溫至80℃，攪拌1 h；加入5.0 mL偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（KH-560），攪拌4 h；烘箱100℃烘15 h至干燥；用水淋洗基質(zhì)載體數(shù)次，再用乙醇淋洗數(shù)次，然后烘箱70℃烘4 h至完全干燥，得到白色固體顆粒，再用研缽研磨，得到白色粉末狀環(huán)氧化二氧化硅基質(zhì)載體?；|(zhì)載體合成的方程式如下：

以乙醇為溶劑，在乙酸催化作用下，使正硅酸乙酯（TEOS）水解，得到水解產(chǎn)物。

以KH-560為偶聯(lián)劑，與前述步驟中得到的水解產(chǎn)物進(jìn)行縮合反應(yīng)，制備含高活性基團(tuán)的環(huán)氧化二氧化硅基質(zhì)載體，該基質(zhì)載體為穩(wěn)定固體狀凝膠。

1.3環(huán)氧化二氧化硅基質(zhì)載體的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜（FT-IR）分析：采用傅里葉變換紅外光譜儀，溴化鉀（KBr）壓片制樣，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

13C NMR固體核磁譜分析：采用核磁共振波譜儀測(cè)定產(chǎn)物的固體核磁CP/MAS13C NMR譜，觀測(cè)頻率75.0 MHz，魔角自旋速度3.8 MHz，分辨率4.88 Hz；內(nèi)參考物：氨基乙酸。

X-射線衍射分析：采用X-射線衍射儀分析樣品結(jié)晶度。掃描方式：定性，步進(jìn)掃描；掃描速度：10°·min-1；掃描范圍為2θ：10°～50°；步長(zhǎng)：0.02°；電壓/電流：35 kV/30 mA；Cu2+靶。

1.4纖維素固載酶的制備

準(zhǔn)確稱取1.5 g環(huán)氧化二氧化硅基質(zhì)載體，加入25.0 mL pH 5.0的1.0 g·L-1纖維素酶的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，室溫下浸漬2 h，過濾，獲得固載酶，用pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液淋洗固載酶數(shù)次，除去固載酶表面的游離酶。

固定化酶制備過程如下：

高溫烘干凝膠并淋洗，再次烘干研磨后為白色粉末狀。取基質(zhì)載體與纖維素酶溶液反應(yīng)，環(huán)氧化二氧化硅基質(zhì)載體上的環(huán)氧基與纖維素酶上的氨基發(fā)生共價(jià)鍵聯(lián)，實(shí)現(xiàn)纖維素酶的固定。

1.5納米纖維溶液制備

根據(jù)文獻(xiàn)［16］，按照m（納米纖維）∶m（溶劑）=1∶50，將納米纖維溶解在9.0 moL·L-1的硫氰酸鋰（LiSCN）溶液中，攪拌溶解過濾，去離子水透析3 d后，再將所得溶液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的納米纖維溶液。

1.6納米纖維溶液表征

Zeta電位和粒度分析，Zeta電位是表征顆粒分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)［17］，因此，納米纖維溶液的Zeta電位也是表征納米纖維能否在溶液中穩(wěn)定存在及粒徑大小的重要指標(biāo)。將所得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%納米纖維溶液配成0.06 g·mL-1水溶液，采用90 Plus Zeta型Zeta電位及粒度分析儀測(cè)試樣品的粒徑及Zeta電位。

1.7酶學(xué)性能測(cè)定

1.7.1 pH值和溫度對(duì)纖維素酶活性的影響取0.5 g固載酶和游離酶在40℃，pH 3.0～8.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1的羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液和納米纖維素（NCC）溶液進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)20 min，采用濾紙酶活（FPA）測(cè)定酶活［18］，考察pH值對(duì)酶活性的影響。將固載酶和游離酶在40～80℃溫度范圍內(nèi)和pH 5.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1CMC溶液和NCC溶液進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)20 min，測(cè)定酶活，考察溫度對(duì)酶活性的影響。

1.7.2纖維素酶的重復(fù)利用性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的測(cè)定將纖維素固載酶和纖維素游離酶分別與2.0 mL 6.0 g·L-1CMC溶液和NCC溶液在40℃，pH 5.0的條件下，反應(yīng)20 min，重復(fù)反應(yīng)6次，測(cè)定酶活，考察酶的重復(fù)利用性。將纖維素固載酶和纖維素游離酶儲(chǔ)存在4℃冰箱內(nèi)，隔7 d取定量0.5 g的固定化酶和游離酶在40℃，pH 5.0條件下，分別與2.0 mL 6.0 g·L-1羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液和納米纖維素（NCC）進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活，考察酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

1.7.3纖維素酶的米氏常數(shù)的測(cè)定將固載酶與纖維素游離酶分別與1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 g·L-1的CMC溶液和NCC溶液進(jìn)行反應(yīng)，20 min后，分別在之后的第2，5，8，11，14，17，20 min條件下測(cè)定酶活，以反應(yīng)速率的倒數(shù)對(duì)底物濃度的倒數(shù)作圖，經(jīng)線性擬合得出米氏方程和米氏常數(shù)Km值［19］。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1新型固載材料的表征

基質(zhì)載體的紅外光譜（FT-IR）分析結(jié)果如圖1所示。由圖1可見：中間產(chǎn)物二氧化硅和基質(zhì)載體在3 650 cm-1處都有—OH的特征吸收峰；在1 110和1 100 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收峰較寬，是由Si—O和C—O鍵特征吸收峰的重疊造成的；在798和800 cm-1處為環(huán)氧基的特征吸收峰；在2 940 cm-1處，中間產(chǎn)物無—CH2—的特征吸收峰，基質(zhì)載體有該特征吸收峰，說明中間產(chǎn)物二氧化硅和偶聯(lián)劑KH-560實(shí)現(xiàn)了共價(jià)鍵聯(lián)，從對(duì)IR的分析，可以初步判斷基質(zhì)載體合成成功。

圖1　中間產(chǎn)物二氧化硅和基質(zhì)載體的IR譜Figure 1 IR spectra of the intermediate and the carrier

基質(zhì)載體的13C NMR固體核磁譜分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在0～50 mg·L-1間存在強(qiáng)度約為1∶2∶1的13C信號(hào)峰，說明合成的基質(zhì)載體含有R—CH2—R結(jié)構(gòu)，在50～80 mg·L-1存在13C信號(hào)峰，說明了基質(zhì)載體中C—O的存在，與目標(biāo)基質(zhì)載體環(huán)氧化二氧化硅結(jié)構(gòu)相符，說明基質(zhì)載體合成成功。

圖2　基質(zhì)載體的CP/MAS13CNMR譜Figure 2 CP /MAS13C-NMR spectroscopy of intermediates and the carrier

基質(zhì)載體的X-射線衍射（XRD）分析結(jié)果如圖3所示。

圖3　中間產(chǎn)物及基質(zhì)載體的X-射線衍射圖譜Figure 3　X-ray diffraction spectra of intermediates and the carrier

由圖3數(shù)據(jù)，結(jié)晶度按式（1）計(jì)算，數(shù)據(jù)列于表1。

表1　基質(zhì)載體的結(jié)晶度Table 1　Degree of crystallinity of intermediate and the carrier

式（1）中：Xc為結(jié)晶度，Sc為X-射線衍射圖譜中結(jié)晶區(qū)部分面積，k為校正因子，Sa為X-射線衍射圖譜中非結(jié)晶區(qū)部分面積。

由圖3可知：縮合反應(yīng)前后峰的形狀沒有發(fā)生太大變化，中間產(chǎn)物的結(jié)晶度為46.30%，基質(zhì)載體的結(jié)晶度43.54%，僅略有減小，說明偶聯(lián)劑KH-560的加入對(duì)中間產(chǎn)物二氧化硅試樣的結(jié)構(gòu)并無太大影響。綜合分析表明，成功合成獲得了新型硅基載體材料。

2.2固載酶及游離酶酶解不同微觀尺度下的纖維素基質(zhì)性能

2.2.1自制納米纖維粒徑的測(cè)定自制納米纖維素粒子數(shù)量與粒徑的分布關(guān)系如圖4所示。由圖4可知：納米纖維素的粒徑分布在105 nm取得最大值，納米纖維素的平均粒徑接近納米尺寸，粒徑較小。

2.2.2 Zeta電位的測(cè)定一般文獻(xiàn)認(rèn)為［20］，對(duì)于非納米粒子，Zeta電位絕對(duì)值在30 mV以上的穩(wěn)定性較好，但是由于納米粒子的粒徑較小，單個(gè)粒子表面提供電荷的官能團(tuán)的數(shù)量較少，可能會(huì)引起所測(cè)得的Zeta電位絕對(duì)值偏低。本工作由Zeta電位儀測(cè)得所制備的納米纖維素的Zeta電位為-29.72 mV，可認(rèn)為穩(wěn)定性較好。

圖4　數(shù)量-粒徑分布關(guān)系圖Figure 4 Graph of relationship between number and the particle size distribution

2.2.3固定化酶最適pH值的范圍將纖維素固載酶和游離酶在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)與分別與CMC溶液和NCC溶液反應(yīng)，測(cè)定固載酶和游離酶的活性，結(jié)果見圖5。由圖5可知：無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的最適pH值都為pH 4.0，游離酶的最適pH值都為pH 5.0。CMC與2種形態(tài)酶的反應(yīng)程度都較NCC高，可能原因?yàn)樽灾萍{米纖維溶液溶質(zhì)粒徑雖達(dá)到納米級(jí)要求，但是顆粒大小不均勻，因此，底物為CMC時(shí)的酶促反應(yīng)效果較底物為NCC時(shí)好。

圖5　pH對(duì)酶活性的影響Figure 5　Effect of pH value on the enzymatic activity

2.2.4固定化酶最適溫度的范圍將纖維素固載酶和游離酶在40～80℃的范圍內(nèi)和pH 5.0的條件下，分別與CMC溶液和NCC溶液反應(yīng)，測(cè)定固載酶和游離酶的活性，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的最適溫度都為60℃，游離酶的最適溫度都為50℃，說明固載酶較游離酶有更好的熱穩(wěn)定性。這是因?yàn)槔w維素固載酶的接枝長(zhǎng)鏈對(duì)纖維素酶具有一定的包埋作用，使固載酶的剛性增加，必須升高溫度增加柔性，才能和底物分子結(jié)合。

圖6　溫度對(duì)酶活性的影響Figure 6　Effect of tempertature on the enzymatic activity

2.2.5固定化酶的重復(fù)使用性將固載酶和游離酶在pH 5.0和40℃條件下與CMC溶液與NCC溶液反應(yīng)，測(cè)定固載酶和游離酶的活性。重新裝入底物溶液，再次反應(yīng)后測(cè)定酶活性，如此反復(fù)操作6次，結(jié)果見圖7。由圖7可知：經(jīng)過6次反應(yīng)后，固載酶對(duì)于底物CMC溶液的酶活性高于NCC溶液，表明固載酶對(duì)于CMC溶液有更好的重復(fù)利用性。酶活性逐步下降的可能原因?yàn)榈孜镏鸩竭M(jìn)入基質(zhì)載體的孔道，與固載酶發(fā)生作用或部分以游離形態(tài)被束縛在基質(zhì)載體中的酶隨反應(yīng)進(jìn)行逐步與基質(zhì)載體脫離從而與底物發(fā)生作用，使得酶不斷被消耗數(shù)量減少，表現(xiàn)為活性降低。

圖7　酶的重復(fù)利用性Figure 7 Reusability of cellulase

2.2.6纖維素酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性將固載酶和游離酶儲(chǔ)存于4℃的冰箱內(nèi)，隔7 d，測(cè)定1次酶活，連測(cè)28 d，結(jié)果見圖8。由圖8可知：28 d后，無論底物是CMC溶液，還是NCC溶液，固載酶的酶活性都高于游離酶，說明固載酶較游離酶有更好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。這是因?yàn)槊概c基質(zhì)載體結(jié)合生成固載酶以后結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，抵抗外界環(huán)境對(duì)酶活的影響。

圖8　酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Figure 8　Storage stability of cellulase

2.2.7纖維素酶米氏常數(shù)的測(cè)定在溫度、pH值及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度有很大的影響。底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度隨底物濃度的增加迅速增加，隨反應(yīng)底物濃度繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開始減慢，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ㄖ禃r(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到最大極限。底物濃度［S］與酶反應(yīng)速率v間的定量關(guān)系由米氏方程給出：

用酶反應(yīng)速率的倒數(shù)對(duì)底物濃度的倒數(shù)作圖，經(jīng)線性擬合，結(jié)果列于圖9和表2。結(jié)果表明：固載酶與CMC溶液和NCC溶液作用的米氏常數(shù)分別為1.58 g·L-1和2.36 g·L-1；游離酶與CMC溶液和NCC溶液作用的米氏常數(shù)分別為1.40 g·L-1和2.12 g·L-1，表明固載酶與底物的親和力較游離酶有所減小，可能原

圖9　Lieweaver-Burk曲線Figure 9 Lieweaver-Burk curves

式（2）中：v為反應(yīng)初速率，V為最大反應(yīng)速率，［S］為底物濃度，Km為米氏常數(shù)，Km值等于酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度。Km是酶的特性常數(shù)之一，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)，不同的酶Km值不同，同一種酶與不同底物反應(yīng)Km值也不同。Km值可近似地反映酶與底物的親和力大?。篕m值大，表明親和力??；Km值小，表明親和力大。米氏方程兩邊同時(shí)取倒數(shù)，得到：因?yàn)楣梯d酶由于基質(zhì)載體的阻礙作用，減少了酶與底物的接觸面積，使得相較游離酶親和力有所減小。2種形態(tài)的纖維素酶對(duì)CMC的親和力比對(duì)NCC的親和力強(qiáng)，可能原因?yàn)樽灾萍{米纖維溶液溶質(zhì)粒徑雖達(dá)到納米級(jí)要求，但由于NCC顆粒大小的不均勻性，使得較底物為CMC時(shí)酶促效果稍差，表現(xiàn)為親和力有所減小。

表2　游離酶與固定化酶的米氏常數(shù)Table 2 Kmvalue of free and immobilized cellulose

3　結(jié)論

自制纖維素溶液的粒徑分布在105 nm左右，接近納米纖維素級(jí)別；Zeta電位為-29.72 mV，說明納米纖維素溶液穩(wěn)定性較好。將所制備的纖維素固載酶的酶學(xué)性能與纖維素游離酶相比較的結(jié)果表明：無論底物是羧甲基纖維素鈉，還是納米纖維素，此固載酶進(jìn)行酶促反應(yīng)的最優(yōu)pH值都為pH 4.0左右，最優(yōu)溫度都為60℃，比游離酶提高10℃，表明固載酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。此外，固載酶的重復(fù)利用性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性與游離酶相比都有較大的提高。測(cè)得固載酶的米氏常數(shù)比游離酶稍大，表明其與底物的親和力與游離酶相比有所減小。

4　參考文獻(xiàn)

［1］DONG Zeyuan, ZHU Junyan, LUO Quan, et al.Understanding enzyme catalysis by means of supramolecular artificial enzymes［J］.Sci China Chem, 2013, 56（8）: 1067 - 1074.

［2］CARPITA N C.Update on mechanisms of plant cell wall biosynthesis: how plants make cellulose and other（1,4）-β-D-glycans［J］.Plant Physiol, 2011, 155（1）: 171 - 184.

［3］周秀梅,夏黎明.纖維素酶在織物整理中的應(yīng)用［J］.紡織學(xué)報(bào)，2004，25（3）：114 - 115.ZHOU Xiumei, XIA Liming.The application of cellulase in bio-finishing of cellulosic fabrics［J］.J Text Res, 2004, 25 （3）: 114 - 115.

［4］任大明，陳祖潔.纖維素酶在蔬菜汁加工中的應(yīng)用研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，25（1）：79 - 82.REN Daming, CHEN Zujie.The application of cellulase in vegetable juice processing［J］.J Shenyang Agric Univ, 1994, 25（1）: 79 - 82.

［5］汪順才,肖寶清,張強(qiáng).纖維素酶在廢紙脫墨中的應(yīng)用［J］.中國(guó)礦山工程，2005，34（2）：38 - 41.WANG Shuncai, XIAO Baoqing, ZHANG Qiang.Application of cellulase in waste paper deinking［J］.China Mine Eng, 2005, 34（2）: 38 - 41.

［6］李存存，張光亞.酶定向固定化方法及應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，2013，32（10）：2467 - 2474.LI Cuncun, ZHANG Guangya.Research progress of site-specific immobilization of enzymes and application［J］.Chem Ind Eng Progr，2013，32（10）：2467 - 2474.

［7］閔丹丹，何文，杜曉永，等.酶固定化無機(jī)載體材料的研究進(jìn)展［J］.山東陶瓷，2011，34（5）：11 - 16.MIN Dandan, HE Wen, DU Xiaoyong, et al.Research progress of inorganic materials used as enzyme immobilization carrier［J］.Shandong Ceram，2011，34（5）：11 - 16.

［8］張蕾蕾，王固寧，朱遂一，等.酶固化技術(shù)最新研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11（22）：4386 -4397.ZHANG Leilei, WANG Guning, ZHU Suiyi, et al.Recent advancement of enzyme immobilized technology［J］.Progr Mod Biomed，2011，11（22）：4386 - 4397.

［9］崔少偉，唐正華，葛建芳.正硅酸乙酯溶膠-凝膠制備殼聚糖-SiO2雜化材料［J］.中北大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（3）：313 - 319.CUI Shaowei, TANG Zhenghua, GE Jianfang.Preparation of chitosan-SiO2hybrid composite material via tetraethy loxy silane sol-gel process［J］.J North Univ China, 2012, 33（3）: 313 - 319.

［10］廖明霞，李曄，楊惠，等.包埋生物分子的SiO2載體材料的研究進(jìn)展［J］.有機(jī)硅材料，2009，23（4）：265 -268.LIAO Mingxia, LI Ye, YANG Hui, et al.Research on SiO2carrier for entrapment of biomolecules［J］.Silicone Mat，2009, 23（4）: 265 - 268.

［11］厲瑾，宋錫瑾，徐佳音,等.蛋白質(zhì)的單分子包埋［J］.化學(xué)通報(bào)，2011，74（1）：10 - 15.LI Jin, SONG Xijin, XU Jiayin, et al.The encapsulation of single protein［J］.Chem Rep, 2011, 74（1）: 10 - 15.

［12］孫玉英，張繼泉.吸附交聯(lián)法和包埋法固定化混合酶研究［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，22（3）：82 - 88.SUN Yuying, ZHANG Jiquan.Comparative study of crude enzyme immobilization by cross-linking and entrapment methods［J］.J Huaihai Inst Technol Nat Sci Ed, 2013, 22（3）: 82 - 88.

［13］陳奎,李伯耿,曾光明.有機(jī)硅氧烷水解、縮聚的影響因素研究［J］.化工新型材料，2010，38（1）：110 - 111.CHEN Kui, LI Bogeng, ZENG Guangming.Influence factors of hydrolysis and condensation of organic silicon oxygen alkyl［J］.New Chem Mat, 2010, 38（1）: 110 - 111.

［14］李峰，李紅強(qiáng)，賴學(xué)軍，等.γ-巰丙基三甲氧基硅烷對(duì)納米二氧化硅表面接枝改性的研究［J］.無機(jī)鹽工業(yè)，2014，46（4）：33 - 36.LI Feng, LI Hongqiang, LAI Xuejun, et al.Suface grafting modifecation of nano-sized silica with 3-mercaptopropyl trimethoxysilane［J］.Inorganic Chem Ind，2014，46（4）：33 - 36.

［15］雷鳴，王艷，趙昊，等.C型硅膠與偶聯(lián)劑KH-560鍵合反應(yīng)初探［J］.化工進(jìn)展，2012，31（6）：1263 - 1273.LEI Ming, WANG Yan, ZHAO Hao.Study on the reaction of typy C silica gel and KH-560 coupling agent［J］.Chem Ind Eng Progr, 2012, 31（6）: 1263 - 1273.

［16］王曉磊，戴衛(wèi)國(guó)，何建新，等.柞蠶絲素水溶液靜電紡納米纖維的制備［J］.材料科學(xué)與工程學(xué)報(bào)，2012，30 （2）：287 - 290.WANG Xiaolei, DAI Weiguo, HE Jianxin, et al.Electrospun nanofibers from TSF aqueous solution［J］.J Mat Sci & Eng, 2012, 30（2）: 287 - 290.

［17］MURDOCH C, REEVES K J, HEARNDEN V, et al.Internalization and biodistribution of polymersomes into oral squamous cell carcinoma cells in vitro and in vivo［J］.Nanomedicine, 2010, 5（7）: 1025 - 1036.

［18］張瑞萍.纖維素酶活力測(cè)定方法［J］.印染，2002，28（8）：38 - 40.ZHANG Ruiping.Activity determination of cellulose［J］.Dye Finish, 2002, 28（8）: 38 - 40.

［19］GUAN Zhengjun, LUO Qian, CHEN Xi, et al.Saline soil enzyme activities of four plant communities in Sangong River basin of Xinjiang, China［J］.J Arid Land, 2014, 6（2）: 164 - 173.

［20］ROBINSON K L, de PAZ-Bá?EZ M V, WANG X S, et al.Synthesis of well-defined, semibranched，hydrophilic-hydrophobic block copolymers using atom transfer radical polymerization［J］.Macromolecules, 2001, 34（17）: 5799 -5805.

Preparation and performance of novel immobilized cellulase

FU Xiaoping, YAO Shanshan, WANG Ying, GUO Ming
（School of Sciences, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:A novel carrier was synthesized by condensation reaction with an acid catalytic action using tetraethyl orthosilicate and KH-560 as the silica resource and coupling reagent, respectively.The composition and structure of the carrier were characterized by infrared absorption spectroscopy,(13)C nuclear magnetic resonance, and X-ray diffractometry.The novel immobilized cellulase was prepared by the crosslinking-embedding immobilized method.The enzymatic characteristics of the immobilized cellulase were tested and compared with that of free cellulase.Experimental results showed that the immobilized cellulase maintained higher activity in the broader ranges of pH and temperature.The Michaelis constant（Km）of immobilized cellulase（1.58 g·L(-1)）is similar as the free cellulase（1.40 g·L(-1)）.Thus, immobilized cellulase could have a stronger affinity, reusability, and storage stability; and could provide a reference for preparing immobilized enzymes to perform better.［Ch, 9 fig.2 tab.20 ref.］

Key words:cellulase; crosslinking and embedding; immobilized; catalytic property

作者簡(jiǎn)介：傅小萍，從事生物質(zhì)材料研究。E-mail：1940468653@qq.com。通信作者：郭明，教授，博士，從事生物質(zhì)材料研究。E-mail：guoming@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014R412026, 201111030107）

收稿日期：2014-04-20；修回日期：2015-06-29

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.018

中圖分類號(hào)：TQ352.2；S7-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）02-0315-07