楊　一1，張　娟2，朱海榮2

(1.上?；ぱ芯吭骸∩虾！?00062； 2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院　山東濟南　250100)

?

高效液相色譜法同時檢測葉面肥料中4種植物生長調(diào)節(jié)劑的研究

*

楊一1，張娟2，朱海榮2

(1.上?；ぱ芯吭荷虾?00062； 2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院山東濟南250100)

摘要通過試驗，建立了同時測定葉面肥料中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸4種植物生長調(diào)節(jié)劑的高效液相色譜分析方法。試驗結(jié)果表明：在樣品采用甲醇提取、以甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相、采用梯度洗脫、進樣量10 μL、柱溫35 ℃的條件下，測試樣品的測定結(jié)果在1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.1 mg/L；在0.05%，0.50%和5.00%添加水平上，方法的平均回收率在90.0%～105.0%之間，相對標準偏差(RSD)<5%(n=6)；該方法通用性強、選擇性好、靈敏度高，可滿足葉面肥料中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸4種植物生長調(diào)節(jié)劑同時檢測的要求。

關(guān)鍵詞高效液相色譜法葉面肥料氯吡脲烯效唑萘乙酸脫落酸

Study of Determination of Four Plant Growth Regulators in Foliar Fertilizers Simultaneously with High Performance Liquid Chromatography

YangYi1, Zhang Juan2, Zhu Hairong2

(1.Shanghai Research Institute of Chemical IndustryShanghai200062；2.Shandong Institute for Product Quality InspectionShandong Jinan 250100)

AbstractThrough experiment, an analysis method for determination of forchlorfenuron, uniconazole, naphthylacetic acid and abscisic acid in foliar fertilizers at the same time with high performance liquid chromatography is established. Experimental results show that under conditions that samples are extracted with methanol, methanol and 0.1% formic acid aqueous solution are used as mobile phase, gradient elution is used, the injection volume of the sample is 10 μL and column temperature is 35 ℃, in the range of 1.0～100.0 mg/L of sample tested, the method has a good linear relation, the limit of determination is 0.1 mg/L; at concentration levels of 0.05%, 0.50% and 5.00%, the mean recoveries are between 90.0% and 105.0% with relative standard deviations less than 5% (n=6). This method has the characteristics of high universality, good selectivity and high sensitivity, it can meet the requirements of determination of four plant growth regulators, forchlorfenuron, uniconazole, naphthylacetic acid and abscisic acid, in foliar fertilizers at the same time.

Keywordshigh performance liquid chromatographyfoliar fertilizerforchlorfenuronuniconazolenaphthylacetic acidabscisic acid

氯吡脲、萘乙酸、脫落酸和烯效唑是國內(nèi)外廣泛使用的4種植物生長調(diào)節(jié)劑，其中：氯吡脲對植物生長起促進作用，廣泛應(yīng)用于獼猴桃、葡萄、蘋果、黃瓜等作物上[1]；萘乙酸可以增加坐果、防止落果和改變雌雄花比率[2]；脫落酸可以抑制種子提前萌發(fā)、誘導(dǎo)休眠，用于種子的儲藏[3]；烯效唑作為植物生長延緩劑，廣泛應(yīng)用于果樹、煙草和花卉等植物[4]。隨著施肥技術(shù)的發(fā)展，近年來葉面施肥已成為強化作物吸收營養(yǎng)和防止發(fā)生某些缺素癥狀的有效措施，但在葉面肥生產(chǎn)、銷售過程中非法添加農(nóng)藥(包括植物生長調(diào)節(jié)劑)的現(xiàn)狀，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全存在重大隱患[5]，建立肥料中這些物質(zhì)的檢測方法尤為迫切。

氯吡脲和烯效唑含量的檢測多采用高效液相色譜(HPLC)法[6- 12]，萘乙酸的檢測可采用化學(xué)法、氣相色譜法和液相色譜法[13- 16]，而HPLC法和放射免疫法常被用于檢測脫落酸[17- 18]。目前，對多種組分的同時檢測技術(shù)研究較少，且存在樣品前處理過程復(fù)雜、溶劑消耗多、分析時間長等問題；另外，關(guān)于植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測通常見于蔬菜、水果中的殘留分析，對葉面肥料中的植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測研究報道甚少。本試驗采用高效液相色譜技術(shù)建立了對葉面肥中氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸4種植物生長調(diào)節(jié)劑同時定量檢測的方法，彌補了葉面肥中植物生長調(diào)節(jié)劑檢測方法的空白。本試驗的主要技術(shù)優(yōu)勢：以甲醇-甲酸水溶液為流動相，易于配制；以甲醇作為提取劑，樣品前處理方法簡單、快捷。通過試驗，氯吡脲、烯效唑、萘乙酸及脫落酸4種待測物含量在1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)在0.999以上，最低檢出限為0.1 mg/L，檢測方法具有通用性強、選擇性好、靈敏度高、可操作性強的優(yōu)勢，完全能夠滿足葉面肥料中4種植物生長調(diào)節(jié)劑的同時測定。

1試驗部分

1.1主要儀器和試劑

Waters e2695高效液相色譜儀、二極管陣列(PDA)檢測器、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司)，Milli- Q超純水器(美國Millipore公司)，Sigma 3- 18K高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，電子天平(瑞士Sartorius公司)，SIR漩渦混合器(德國IKA公司)。

氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，相應(yīng)標準品化學(xué)結(jié)構(gòu)、CAS號、分子式和相對分子質(zhì)量等見圖1；甲醇為色譜純(美國Fisher公司)，其余試劑均為分析純(北京化工廠)；水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

圖1　4種化合物的CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量

1.2液相色譜條件

所選用的色譜柱為Symmetry Shield RP18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為甲醇(簡稱A)和質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸水溶液(簡稱B)；色譜分離采用梯度洗脫程序，即0.0～7.0 min為30%～45%A，7.0～13.0 min為45%～55%A，13.0～18.0 min為55%～80%A，18.0～26.0 min為80%～90%A，26.0～26.1 min為90%～30%A，26.1～33.0 min為30%A；流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.3樣品前處理

固體樣品：稱取2.0 g(精確至0.001 g)已粉碎樣品置于50 mL比色管中，加入20 mL甲醇，渦旋振蕩3 min至樣品完全溶解，以8 000 r/min離心分離10 min，移取1 mL上清液至10 mL容量瓶中并定容至刻度，取定容后的溶液過0.45 μm有機相濾膜，待測。

液體樣品：直接稱取樣品2.0 g(精確至0.001 g)，處理方法同固體樣品。

2結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇

按照試驗方法分別對4種化合物的標準溶液(50 mg /L)在190～490 nm范圍內(nèi)進行全波段掃描，分析所得光譜圖和液相色譜圖得知，氯吡脲最大吸收波長為262 nm，烯效唑最大吸收波長為254 nm，萘乙酸最大吸收波長為280 nm，脫落酸最大吸收波長為245 nm。為簡化操作或提高紫外檢測器的適用性，選擇氯吡脲、烯效唑和脫落酸最佳同時檢測波長為250 nm，萘乙酸最佳檢測波長為280 nm。

2.2提取溶劑的選擇

在同一樣品(經(jīng)測定不含氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸)中添加適量氯吡脲、烯效唑、萘乙酸和脫落酸混合標樣溶液，混合后用氮氣流緩慢吹干，然后分別以甲醇、30%(質(zhì)量分數(shù)，下同)甲醇-水、30%甲醇-0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑，比較不同提取溶劑的提取效率。結(jié)果表明，甲醇的提取效率最高，相應(yīng)的回收率以及精密度見

表1。4種化合物在甲醇中的溶解度較高，可以保證較好的提取效果，故選擇甲醇作為提取溶劑。

表14種化合物的回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)

提取溶劑待測物加入量/%回收率/%相對標準偏差(RSD)/%甲醇氯吡脲0.594.391.45烯效唑0.597.711.59萘乙酸0.5104.401.43脫落酸0.592.213.3730%甲醇-水氯吡脲0.575.263.28烯效唑0.579.151.65萘乙酸0.581.562.57脫落酸0.576.223.4130%甲醇-0.1%甲酸水溶液氯吡脲0.575.563.28烯效唑0.578.132.91萘乙酸0.579.292.67脫落酸0.574.243.55

2.3流動相的選擇

4種待測物的醇溶性均較好，在RP18色譜柱上的保留行為合適。本試驗選擇Waters公司粒徑為5 μm的Symmetry Shield RP18柱(250 mm×4.6 mm)為色譜分離柱，比較了甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液最優(yōu)條件液相色譜圖，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2　以甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相時的液相色譜圖

圖3　以甲醇-水為流動相時的液相色譜圖

圖4　以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時的液相色譜圖

以甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相時，脫落酸(保留時間tR=18.897 min)和萘乙酸(tR=20.483 min)的峰形較差；以甲醇-水為流動相時，4種化合物基本可以實現(xiàn)分離，但峰有拖尾現(xiàn)象(脫落酸t(yī)R=15.507 min，萘乙酸t(yī)R=19.455 min，氯吡脲tR=21.059 min，烯效唑tR=22.885 min)；最終發(fā)現(xiàn)，在RP18鍵合固定相上分離試樣中的化合物，選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，4種化合物可以實現(xiàn)有效分離，各化合物保留時間適中、峰形良好，在250 nm波長下的保留時間分別為脫落酸7.706 min、萘乙酸10.582 min、氯吡脲19.310 min和烯效唑22.566 min。

2.4線性范圍和方法定量限

在本方法所確定的色譜條件和待測物含量1.0～100.0 mg/L范圍內(nèi)，對4種化合物的混合標液按質(zhì)量濃度從低到高進樣分析測定，4種化合物測定結(jié)果的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。采用在空白樣品中添加目標化合物的方法，也可以得到相近的線性范圍和定量限。試驗結(jié)果表明，該方法測定4種化合物的檢出限為0.1 mg/L，定量范圍為1.0～100.0 mg/L，測定范圍寬，色譜分離效果好。

表24種化合物測定結(jié)果的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

待測物線性范圍/(mg·L-1)線性回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限/(mg·L-1)氯吡脲1.0～100.0Y=6.38×104X-4.62×1040.99990.1烯效唑1.0～100.0Y=3.17×104X-2.42×1040.99980.1萘乙酸1.0～100.0Y=2.15×104X-1.69×1040.99990.1脫落酸1.0～100.0Y=4.59×104X-3.59×1040.99990.1

2.5方法回收率和精密度

在空白樣品中添加標準溶液進行加標回收率試驗，取6個平行樣，按本方法進行提取處理并分析測定，計算添加回收率和精密度，試驗結(jié)果如表3所示。

由表3可知，平均回收率在90.0%～105.0%，相對標準偏差(RSD)在0.85%～3.37%，表明本方法可滿足檢測要求，具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

表3肥料中4種化合物的回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)

待測物加入量/%回收率/%相對標準偏差(RSD)/%氯吡脲0.05,0.50,5.0090.31,94.39,86.450.85,1.45,3.15烯效唑0.05,0.50,5.0094.36,97.71,90.240.98,1.59,2.56萘乙酸0.05,0.50,5.0089.45,104.40,92.382.67,1.43,3.09脫落酸0.05,0.50,5.0089.20,92.21,96.352.46,3.37,3.21

2.6實際樣品檢測

選取30批次市售葉面肥樣品依次編號，按本方法進行提取處理并分析測定，測定結(jié)果如表4所示。

由表4檢測結(jié)果可知，7個批次的液體肥料樣品中含有植物生長調(diào)節(jié)劑，其中1號和7號含有脫落酸，6號和10號含有萘乙酸，3號含有氯吡脲，9號和16號含有烯效唑。

表4實際樣品檢測結(jié)果

樣品編號w(氯吡脲)/%w(烯效唑)/%w(萘乙酸)/%w(脫落酸)/%10.000.000.000.6530.280.000.000.0060.000.002.890.0070.000.000.000.8690.000.580.000.00100.000.001.560.00160.000.780.000.00

3結(jié)語

通過試驗所建立的高效液相色譜法適用于同時檢測葉面肥中的脫落酸、萘乙酸、氯吡脲以及烯效唑含量，檢出限為0.1 mg/L，定量范圍為1.0～100.0 mg/L，測定范圍寬，色譜分離效果好；在試驗確定的色譜條件下，33 min內(nèi)即能實現(xiàn)待測物的有效分離，基質(zhì)干擾??；樣品測定結(jié)果的相對標準偏差、加標回收率表明該測定方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，同時具有較高的回收率，定量準確，完全可以用于同時檢測葉面肥中的脫落酸、萘乙酸、氯吡脲和烯效唑含量。

參考文獻

[1]雷紹榮，郭靈安，毛建霏，等.氯吡脲殘留檢測技術(shù)進展及趨勢[J].中國測試，2011(6)：53- 56.

[2]王雪娟，魏金旺.α- 萘乙酸的分析方法研究[J].色譜，2000(6)：563- 565.

[3]丁君輝，李耀國，童建華.脫落酸對水稻種子萌發(fā)的影響[J].作物研究，2012(4)：328- 330.

[4]張良，王泉振，王寧，等.直接競爭酶聯(lián)免疫吸附-高效液相色譜法測定烯效唑[J].分析化學(xué),2012(11):1 730- 1 734.

[5]張慧，吳穎，路勇，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蘋果中的赤霉素、脫落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑殘的殘留量[J].食品工業(yè)科技，2010(10)：383- 385.

[6]夏紅英，孫宇輝.高效液相色譜測定烯效唑含量[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，1998(1)：7，10.

[7]于紅，鹿毅，王靜靜，等.HPLC- MS/MS法測定水果中殘留的多效唑和烯效唑[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(1)：187- 193.

[8]M Kobayashi, I Takano, Y Tamura, et al. Clean- up method of forchlorfenuron in agricultural products for HPLC analysis[J].Journal of the Food Hygiene Society of Japan, 2007(5)：148- 152.

[9]黎路，王楠，黃曉晶，等.果蔬中植物生長調(diào)節(jié)劑氯吡脲的高效液相色譜測定方法[J].現(xiàn)代儀器，2012(5)：15- 17.

[10]侯玉茹，楊媛，石磊，等.固相萃取-高效液相色譜法檢測葡萄中氯吡脲的研究[J].食品科技，2011(1)：255- 258.

[11]王靜靜，鹿毅，楊濤，等.HPLC- MS/MS法同時測定果蔬中6種植物生長抑制劑殘留[J].分析測試學(xué)報，2011(2)：128- 134.

[12]牟艷莉，郭德華，丁卓平.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測瓜果中的4種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量[J].色譜，2013(10)：1 016- 1 020.

[13]黃士忠，白清云.測定噴多收中α- 萘乙酸的高效液相色譜法[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展，2000(4)：26- 27.

[14]E Mikami, T Goto, T Ohno, et al. Simultaneous analysis of naproxen, nabumetone and its major metabolite 6- methoxy- 2- naphthylacetic acid in pharmaceuticals and human urine by high- performance liquid chromatography[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2000(5):917- 925.

[15]張瑩，鹿毅，楊濤，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定果蔬中7種植物生長促進劑殘留[J].分析測試學(xué)報，2012(4)：442- 447.

[16]孔德洋，石利利，單正軍，等.萘乙酸殘留的高效液相色譜法測定[J].分析測試學(xué)報，2010(4)：382- 385.

[17]張能剛，徐義俊.脫落酸間接酶聯(lián)免疫檢測法的建立[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991(3)：21- 24.

[18]劉長江，劉旸旸，李書倩，等.HPLC法測定軟棗獼猴桃中內(nèi)源激素脫落酸含量[J].食品研究與開發(fā)，2012(2)：162- 165.

(收到修改稿日期2016- 01- 26)

中圖分類號:TQ447.4；O657.7+2

文獻標識碼:A

文章編號：1006- 7779(2016)02- 0010- 05

作者簡介：楊一(1972—)，女，碩士，高級工程師；yymsds@vip.163.com。通訊作者：張娟(1976—)，女，高級工程師，主要從事肥料、農(nóng)藥等產(chǎn)品質(zhì)量檢測及標準科研研發(fā)工作；ruyue95@163.com。

*基金項目：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目，項目編號2012104012- 3和2012104012- 1。