苦杏仁配方顆粒中苦杏仁苷的定量分析及特征圖譜研究

王迎春 麻景梅 李斯 李軍山 李振江 牛麗穎

摘要：目的 建立苦杏仁配方顆粒中苦杏仁苷的高效液相色譜分析方法及苦杏仁配方顆粒高效液相色譜特征圖譜。方法 采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Dionex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92），檢測波長為207 nm，流速為0.6 mL/min，進樣量10 μL，柱溫為30 ℃，測定苦杏仁配方顆粒中苦杏仁苷的含量，并以苦杏仁苷峰為參照峰分析10批苦杏仁配方顆粒樣品，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》進行相似度評價。結果 苦杏仁苷的線性方程為Y=6.176×10-7X-3.058×10-3，在0.122 5～1.225 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系（r=0.999 8），平均回收率為98.75%（RSD=1.30%）?？嘈尤逝浞筋w粒的特征圖譜由6個共有峰構成，10批樣品的相似度≥0.981。結論 該方法簡便、準確、重復性良好，可用于苦杏仁配方顆粒的質(zhì)量控制。

關鍵詞：苦杏仁配方顆粒；高效液相色譜法；苦杏仁苷；含量測定；特征圖譜

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0087-04

Quantitative Analysis of Amygdalin in Kuxingren Formula Granules and Study on Characteristic Chromatogram WANG Ying-chun1，2，3， MA Jing-mei1，2，3， LI Si1， LI Jun-shan2，3，4， LI Zhen-jiang2，3，4， NIU Li-ying1，2，3 （1. Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050091， China； 2. Hebei TCM Formula Granule Engineering & Technology Research Center， Shijiazhuang 050091， China； 3. TCM Formula Granule Research Center of Hebei Province University， Shijiazhuang 050091， China； 4. Shineway Pharmaceutical Group Ltd， Shijiazhuang 051430， China）

Abstract： Objective To establish an HPLC analytic method for amygdalin in Kuxingren Formula Granules and HPLC characteristic chromatogram. Methods RP-HPLC method was adopted. The determination was performed on Dionex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （8：92） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 207 nm and sample size was 10 μL. The column temperature was 30 ℃. The peak of amygdalin was set as refernce， and 10 batches of samples were analyzed. TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A） was adopted to evaluate similatity. Results The linear equation of amygdalin was Y=6.176×10-7X?3.058×10-3， with a good linear relationship in the range of 0.122 5–1.225 μg （r= 0.999 8）. The average recovery rate was 98.75% （RSD=1.30%）. There were 6 common peaks in the characteristic chromatogram of Kuxingren Formula Granules， and the similarity of 10 batches of samples was higher than 0.981. Conclusion The HPLC method is simple， accurate and reproducible， which can be used for the quality control of Kuxingren Granules.

Key words： Kuxingren Formula Granules； HPLC； amygdalin； content determination； characteristic chromatogram

Prunus armeniaca L.的干燥成熟種子，具有降氣止咳平喘、潤腸通便功效，主要用于治療咳嗽氣喘、胸滿痰多、腸燥便秘等[1]?？嘈尤逝浞筋w粒由苦杏仁飲片經(jīng)提取濃縮制成。為更全面控制苦杏仁配方顆粒的質(zhì)量，本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）對苦杏仁配方顆粒中的苦杏仁苷進行定量分析，并建立苦杏仁配方顆粒的特征圖譜。

1 儀器與試藥

戴安Ultimat3000型高效液相色譜系統(tǒng)（Ultimat3000四元泵，Ultimat3000自動進樣器，Ultimat3000二極管陣列檢測器，Chrome-leon client色譜工作站），CP225D型電子分析天平（賽多利斯公司），JCX-250G超聲清洗機（山東濟寧恒盛超聲機械有限公司）。

苦杏仁配方顆粒（批號分別為14061106、14062107、14062321、14071121、14072308、14082121、14082321、14091109、14092108、14092311），神威藥業(yè)集團有限公司；苦杏仁苷對照品（批號110820-201305），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 苦杏仁苷定量分析

2.1 色譜條件

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取以五氧化二磷干燥24 h的苦杏仁苷對照品10.21 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.021 mg/mL苦杏仁苷儲備液；精密量取儲備液0.6 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得61.26 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，稱取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

精密稱取糊精約0.25 g，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各10 ?L，注入色譜儀，記錄色譜圖，結果陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

2.6 線性關系考察

2.7 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測得苦杏仁苷峰面積，計算得RSD=1.0%，結果表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、18 h進樣10 μL，測得苦杏仁苷峰面積RSD=1.2%，結果表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復性考察

取同一批樣品，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，計算苦杏仁配方顆粒中苦杏仁苷的含量。結果苦杏仁苷平均含量為61.2 mg/g，RSD=0.80%，表明方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品共9份，分別按樣品中苦杏仁苷含量的80%、100%、120%精密加入苦杏仁苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果見表1。

2.11 樣品含量測定

分別取3批樣品（批號分別為14091109、14092108、14092311），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，每份供試品溶液重復測定2 次，計算含量，結果見表2。

3 苦杏仁配方顆粒特征圖譜的建立

3.1 色譜條件

色譜柱：Dionex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；流速：0.6 mL/min；檢測波長：207 nm；柱溫：30 ℃，進樣體積10 μL，在此色譜條件下，對照品及樣品中各色譜峰均得到良好分離[6-10]。

3.2 對照品溶液的制備

取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細，稱取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 特征圖譜方法學考察

3.4.1 精密度試驗 取同一批苦杏仁配方顆粒（批號14091109），按“3.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次。結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，均RSD<3%，表明儀器精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一苦杏仁配方顆粒供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18 h進樣測定。結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯差異，均RSD<3%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.3 重復性試驗 取同一批苦杏仁配方顆粒（批號14091109）共6份，按“3.3”項下方法制備供試品溶液，進行測定。結果各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，均RSD<3%，表明方法重復性良好。

3.5 特征圖譜的構建與評價

3.5.1 特征峰的確定 按“3.1”項下色譜條件對10批苦杏仁配方顆粒進行測定，記錄色譜圖，見圖2?？梢姡V峰1～6為10批樣品的共有峰，因此確定1～6為苦杏仁配方顆粒的特征峰。其中6號峰確認為苦杏仁苷，該峰面積較大且較穩(wěn)定，故選擇該峰作為參照峰（S）。以苦杏仁苷為參照，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果見表3、表4。

3.5.2 相似度評價 將10批苦杏仁配方顆粒特征圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》軟件，采用多點校正將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜，進行相似度評價。10批苦杏仁配方顆粒與對照圖譜的相似度分別為0.993、0.998、0.981、0.989、0.992、0.987、0.989、0.985、0.994、0.988。10批苦杏仁配方顆粒的特征圖譜見圖3。

4 討論

本試驗對色譜條件的選擇參考了2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）苦杏仁含量測定項下條件，選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）為流動相，207 nm為檢測波長，分別考察了1.0、0.8、0.6 mL/min流速下樣品的分離效果，結果表明流速為0.6 mL/min時樣品中的色譜峰分離度高且峰形對稱。

供試品溶液制備方法考察了不同提取溶劑及超聲時間對提取效果的影響，分別考察了以水、50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、100%甲醇、100%乙醇為提取溶劑，超聲提取10、20、30、40、60 min，結果表明以50%甲醇超處理聲30 min提取效果最好，能較完全地將大多數(shù)成分提取出來。

苦杏仁苷是苦杏仁藥材中的主要活性成分，其水溶性好，以苦杏仁苷作為苦杏仁配方顆粒質(zhì)量控制指標是合理可行的。以苦杏仁苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，從10批苦杏仁配方顆粒特征圖譜分析結果可以看出，各色譜峰相對保留時間比較吻合，相對峰面積波動較小，各批樣品的相似度較高，這說明各批次苦杏仁配方顆粒的成分基本相同，且其含量差異不大，均一性較好，表明樣品的生成工藝比較穩(wěn)定。

總之，本試驗采用HPLC對苦杏仁配方顆粒中的苦杏仁苷進行了定量分析，同時建立了苦杏仁配方顆粒特征圖譜，既考慮了苦杏仁配方顆粒有效成分的含量，又考慮了其特征圖譜整體相似度，能較全面地反映苦杏仁配方顆粒的整體質(zhì)量。本試驗所建立的分析方法簡便，具有較好的穩(wěn)定性和重復性，可為苦杏仁配方顆粒的全面質(zhì)量控制和評價提供參考。

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