李小波，褚夫江，沈娟，金小寶

（1.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學基礎學院，廣東廣州510006）

水溶性蠅蛆 甲殼素的提取及紅外光譜分析

李小波1，2，褚夫江1，2，沈娟1，金小寶1，2

（1.廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學基礎學院，廣東廣州510006）

甲殼素是藥用昆蟲蠅蛆的生物活性成分之一，本研究采用酸堿法并輔以微波加熱提取蠅蛆甲殼素，繼而以堿凍融法制備低脫乙酰度的水溶性甲殼素。FTIR光譜分析結果表明，2種樣品均具有3個典型的甲殼素酰胺譜帶特征吸收峰，分別為1 653cm-1和1 621cm-1（Ⅰ）、1 555cm-1（Ⅱ）、1 309cm-1（Ⅲ）（蠅蛆甲殼素初提物），以及1 625cm-1（Ⅰ）、1 524cm-1（Ⅱ）和1 305cm-1（Ⅲ）（水溶性蠅蛆甲殼素）。家蠅蛆水溶性甲殼素的制備有助于拓展其深加式利用。

蠅蛆；水溶性甲殼素；傅里葉紅外光譜

作為一類重要的資源昆蟲，蠅類幼蟲（蠅蛆）含有豐富的蛋白質、脂肪、多糖、礦物質等營養(yǎng)物質，可廣泛應用于食品和動物飼料開發(fā)。此外，蠅蛆還含有甲殼素、溶菌酶、抗菌肽、凝集素等具有藥用價值的生物活性物質，在醫(yī)藥領域也有著廣泛的應用前景[1]。例如，傳統(tǒng)中藥五谷蟲即為家蠅、大頭金蠅及其近緣蠅類昆蟲的干燥幼蟲，其功效主要為清熱解毒，消積導滯；主治毒痢作吐、小兒疳積腹脹、疳瘡、唇疔、褥瘡和深膿皰等。五谷蟲（蠅蛆）在《本草蒙筌》《本草綱目》《本草備要》等明清時期藥學著作及《中藥志》《中國動物藥志》等現(xiàn)代中藥著作中均有收記，在我國歷史上有文獻記載的應用延續(xù)至今已有400余年的歷史。

在蠅蛆的活性成分中，甲殼素是一種天然高分子多糖化合物，甲殼素、殼聚糖（甲殼素的N-脫乙?；a物）及其衍生物具有增強免疫，調節(jié)腸道功能，降低動物體膽固醇，抑制或殺滅多種病原體、抗氧化等生物活性，在醫(yī)藥衛(wèi)生方面可用作抗腫瘤劑、抗高血壓藥、抗微生物劑、傷口敷料、藥物載體和抗?jié)兯幬锏萚2，3]。但是，由于分子間強烈的氫鍵作用，甲殼素不溶于水及常見稀酸、稀堿和有機溶劑，限制了其在醫(yī)藥工業(yè)中的應用。本研究擬從家蠅蛆中提取甲殼素并進一步制備成水溶性甲殼素，以期為拓展蠅蛆中生物活性物質資源的深層次開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

家蠅蛆殼；氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、雙氧水（H2O2）和丙酮（CH3COCH3）等為國產化學純或分析純試劑；微波爐、電熱恒溫干燥箱、酸堿滴定管等為國產儀器；BRUKER TENSOR Ⅱ傅里葉紅外光譜儀（德國），用于測定紅外光譜。

1.2 蠅蛆甲殼素的提取

采用酸堿法并輔以微波加熱提取甲殼素。

1.2.1 脫鈣

稱取蠅蛆殼50g，磨碎后浸滯于250mL 10%HCl溶液并攪拌混勻，把裝有蛆殼-鹽酸混合物的玻璃燒杯置于微波爐中，中火加熱30min，其間取出燒杯攪拌混勻兩三次，加熱完畢后冷卻至室溫，用去離子水重復洗滌沉淀物，直至洗出液的pH=7。

1.2.2 脫蛋白

上述沉淀與250mL 10%NaOH溶液在玻璃燒杯中混合均勻后，同上置于微波爐中加熱并洗滌。

1.2.3 脫色

將上述經稀堿液處理后的沉淀懸浮于50mL 10%H2O2中，置于微波爐，中火加熱10min，冷卻后用水洗滌至pH=7，所得漂白產物即為甲殼素初提物，50℃過夜烘干。

1.3 水溶性甲殼素的制備

以上述漂白產物按文獻[4]所述方法制備水溶性蠅蛆甲殼素，簡述如下：稱取2g甲殼素初提物，在冰浴條件下與40g 48%NaOH溶液攪拌混勻，于-20℃冰凍浸滯過夜，制得溶脹的堿化甲殼素。在冰浴中，向上述溶脹的堿化甲殼素中加入86g碎冰，攪拌，形成清澈的膠狀溶液。將該膠狀溶液在4℃條件下擱置10d（每天攪拌混勻一次），加入4mol/L HCl調節(jié)pH值至7.5～8.0。煮沸溶液30min，直至形成溶脹的膠狀物，離心，得到的沉淀以去離子水洗滌至中性。以10倍體積的水懸浮沉淀，加入2mol/L HCl調節(jié)pH值至6.0～6.5，直到懸浮液變得澄清，然后用紗布過濾。在濾液中加入丙酮，直至白色纖維狀沉淀不再增加，沉淀以90%丙酮溶液洗滌3次，置于60℃電熱恒溫干燥箱烘干。

1.4 脫乙酰度測定

采用酸堿滴定法，按照文獻[5]所述方法進行。準確稱取0.5g水溶性甲殼素樣品，置于250mL三角瓶中，加入標準0.1mol/L HCl標準溶液30mL，攪拌至溶解完全，加入五六滴甲基橙-苯胺藍指示劑，用0.1mol/L NaOH標準溶液滴定游離的HCl至溶液變成淺藍綠色。另取1份水溶性甲殼素樣品，置于105℃烘干至恒重，測定水分。按文獻[5]所列公式計算脫乙酰基度。重復試驗3次。

1.5 紅外光譜鑒定

采用BRUKER TENSOR Ⅱ傅里葉紅外光譜儀測定干燥樣品的紅外光譜（FTIR），配備Diamond ATR（金剛石晶體衰減全反射附件）和DTGS（Deuterated Triglycine Sulfate，氘化三甘氨酸硫酸酯）檢測器。測量時把樣品放置于金剛石晶體上。試驗參數(shù)為：波長掃描范圍4 000～400cm-1，光譜分辨率4cm-1，掃描次數(shù)32。

2 結果與分析

2.1 蠅蛆甲殼素和水溶性甲殼素的制備及脫乙酰度測定

采用酸堿法并輔以微波加熱提取的甲殼素初提物為不溶于水的白色顆粒，以該初提物經濃堿液堿化、凍融處理后制得了水溶性甲殼素。制備的水溶性甲殼素在丙酮中為白色纖維狀沉淀，烘干后為淡黃色顆粒狀固體，可在去離子水中浸漬過夜而溶解，采用酸堿滴定法測得其脫乙酰度為29.43%±0.85%。

本試驗采用了能高效催化和促進化學反應的微波加熱法輔助提取蠅蛆甲殼素。與傳統(tǒng)的加熱方式不同，微波加熱可使溶劑中極性分子的取向隨微波場而變化，導致分子發(fā)生各種形式的運動而形成位移電流和碰撞，從而產生摩擦并最終產生大量的熱，使材料溫度升高，其優(yōu)點是受熱均勻、升溫速度快。在化學工業(yè)中，微波的這種加熱特性有助于提高反應速度和化學產率[6，7]。本研究應用酸堿法并輔以微波加熱提取甲殼素，縮短了酸或堿處理時間，3～4 h內就完成了以傳統(tǒng)酸堿法長時間浸泡處理（需要2～3 d）的過程，大大縮短了操作時間。

甲殼素分子內和分子間有強烈的氫鍵作用，不溶于水、低濃度的酸及常見的有機溶劑，僅溶于濃鹽酸、濃硫酸等，這在一定程度上限制了甲殼素的應用。一般認為，脫乙酰度是影響甲殼素溶解性能的重要因素，當甲殼素的脫乙酰度小于50%時不能溶于水和常見的稀酸[8]，但也有研究把甲殼素經過一定處理后制得脫乙酰度更低的水溶性甲殼素（20%～30%）[9]。本研究以濃堿液處理甲殼素后再在低溫條件下和堿反應制備了低脫乙酰度的水溶性甲殼素，可在室溫或者冰浴條件下在水中浸滯過夜而溶解，擴展了甲殼素的應用范圍。

2.2 蠅蛆甲殼素及水溶性甲殼素的FITR光譜特征

采用BRUKER TENSOR Ⅱ傅里葉紅外光譜儀記錄的蠅蛆甲殼素及水溶性甲殼素的紅外光譜（FTIR）分別見圖1、2，其主要譜帶和歸屬見表1。

圖1 蠅蛆甲殼素初提物的FTIR光譜圖

圖2 水溶性甲殼素的FTIR光譜圖

2種樣品均具有3個典型的酰胺譜帶（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）形成的吸收峰，通過Bruker標準譜庫檢索，鑒定為甲殼素。對比2種制備樣品的FTIR譜圖：蠅蛆甲殼素初提物分別在1 653cm-1和1 621cm-1左右各有1個酰胺Ⅰ譜帶吸收峰，為NH2面內彎曲振動峰，可判定其為α-甲殼素[6，8，10-15]；而水溶性甲殼素僅在1 625cm-1左右有一個酰胺Ⅰ譜帶吸收峰，和文獻中的β-甲殼素的吸收峰單峰在1 655～1 660cm-1不同[6，12-14，16]，因此難以準確地判斷其分子晶體結構類型，這可能是在水溶性甲殼素的制備過程中，濃堿液凍融處理破壞了甲殼素分子內與分子間氫鍵，從而進一步對其分子晶體結構有較大破壞[8]，這種結晶狀態(tài)的變化也可能導致其物理性質如溶解性等發(fā)生變化。

表1 2種甲殼素的FTIR主要譜帶波數(shù)

甲殼素初提物的酰胺Ⅱ譜帶吸收峰出現(xiàn)在1 555cm-1，與文獻報道的α-甲殼素（1 556cm-1）相近[6，8，10-14]；值得注意的是，水溶性甲殼素的酰胺Ⅱ譜帶吸收峰出現(xiàn)在1 524cm-1左右，其酰胺Ⅱ譜帶吸收峰向低波數(shù)偏移，也說明甲殼素初提物分子間的氫鍵作用強烈，而水溶性甲殼素分子中氫鍵較甲殼素少，且氫鍵較弱，締合不明顯[17]。2種樣品的酰胺Ⅲ譜帶吸收峰出現(xiàn)位置較近，分別為1 309cm-1和1 305cm-1左右，均和文獻中報道的α-型甲殼素的酰胺Ⅲ譜帶吸收峰相近[6，8，10-13]。

甲殼素初提物在1 113cm-1左右有一個不對稱面內環(huán)伸縮振動形成的吸收峰，和已有研究[8，11-13，16]相似，而水溶性甲殼素無此吸收峰。此外，甲殼素初提物在3 428cm-1和3 256cm-1左右均有一吸收峰，為O-H伸縮振動和N-H伸縮振動重疊形成的多重吸收峰，分別與多糖殘基上的羥基和氨基（或未脫去的乙酰氨基）對應，這些羥基和氨基存在分子內和分子間氫鍵，且具有α-型甲殼素晶體結構特征。水溶性甲殼素僅在3 334cm-1附近形成一個較寬的吸收峰，可能是由N-H振動峰形成，與β-甲殼素相近，這也從另外一個角度表明水溶性甲殼素分子內和分子間的氫鍵較甲殼素樣品弱[18，19]。

3 結論

采用酸堿法并輔以微波加熱提取了家蠅蛆甲殼素初提物，并進一步制備成水溶性甲殼素。經FTIR圖譜分析鑒定，2種制備樣品均為甲殼素，但水溶性甲殼素的酰胺Ⅰ和Ⅱ譜帶吸收峰均向低波數(shù)發(fā)生了偏移，導致其分子晶體結構和氫鍵發(fā)生變化，影響其溶解性能。

[1]王芳,朱芬,雷朝亮.中國家蠅資源化利用研究進展[J].應用昆蟲學報,2013,50(4):1149-1156.

[2]Hamed I,?zogul F,Regenstein JM.Industrial applications of crustacean by-products (chitin,chitosan,and chitooligosaccharides):A review[J].Trends in Food Science &Technology,2016,47(48):40-50.

[3]Kim SK.Chitin and chitosan derivatives:Advances in drug discovery and developments[M].Boca Raton:CRC Press,2013:337-360.

[4]Li X,Jin X,Lu X,et al.Construction and characterization of a thermostable whole-cell chitinolytic enzyme using yeast surface display[J].World Journal of Microbiology and Biotechnolo gy,2014,30(10):2577-2585.

[5]蔣挺大.殼聚糖[M].2版.北京:化學工業(yè)出版社,2006:88-89.

[6]朱婉萍,孔繁智,黃萍,等.甲殼素及其衍生物的研究與應用[M].杭州:浙江大學出版社,2014:22-185.

[7]Chemat,Farid,Giancarlo Cravotto.Microwave-assisted extraction for bioactive compounds:theory and practice[M].New York:Springer Science &Business Media,2013:1-52.

[8]施曉文,鄧紅兵,杜予民.甲殼素/殼聚糖材料及應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2015:35-142.

[9]Pillai CKS,Paul W,Sharma CP.Chitosan:Manufacture,Properties and Usage[M].New York:Nova Publishers,2010:133-216.

[10]Teng D.From chitin to chitosan[C]//Kangde Yao,Junjie Li,Fanglian Yao,et al.Chitosan-based hydrogels:Functions and application[A].Boca Raton:CRC Press,2012:2-33.

[11]Kaya M,Baran T,Asan-Ozusaglam M,et al.Extraction and characterization of chitin and chitosan with antimicrobial and antioxidant activities from cosmopolitan Orthoptera species (Insecta)[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2015,20(1):168-179.

[12]Kaya M,Seyyar O,Baran T,et al.Bat guano as new and attractive chitin and chitosan source[J].Frontiers in Zoology,2014,14(1):1-10.

[13]Kaya M,Akata I,Baran T,et al.Physicochemical properties of chitin and chitosan produced from medicinal fungus (Fomitopsis pinicola)[J].Food Biophysics,2015,10(2):162-168.

[14]Jang MK,Kong BG,Jeong YI,et al.Physicochemical characterization of α-chitin,β-chitin,and γ-chitin separated from natural resources[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemist ry,2004,42(14):3423-3432.

[15]Cuong HN,Minh NC,Van Hoa N,et al.Preparation and characterization of high purity β-chitin from squid pens (Loligo chenisis)[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,93(Pt A):442-447.

[16]Subhapradha N,Ramasamy P,Shanmugam V,et al.Physicochemical characterisation of β-chitosan from Sepioteuthis lessoniana gladius[J].Food chemistry,2013,141(2):907-913.

[17]董炎明,王勉,吳玉松.殼聚糖衍生物的紅外光譜分析[J].纖維素科學與技術,2001,9(2):42-55.

[18]蔣挺大.甲殼素[M].2版.北京:化學工業(yè)出版社,2003:22-78.

[19]趙維,李建科.不同脫乙酰度蠶蛹殼聚糖結構分析及其清除自由基能力的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(8):90-93,97.

The Preparation of Water-Soluble Chitin from Fly Maggot and FTIR Analysis

Li Xiao-bo1,2,Chu Fu-jiang1,2,Shen Juan1,Jin Xiao-bao1,2
(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances,Guangdong Guangzhou 510006;2.School of Basic Courses,Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Guangzhou 510006)

Chitin is one of the bioactive components of medicinal insect maggots.In this study,fly maggot chitin was extracted by acid-alkali method,assisted by microwave heating,and water-soluble chitin with low deacetylation degree was further prepared by alkali-freezing-thawing treatment.FTIR spectral analysis results showed that the two samples had three typical absorption peaks of amide bands of chitin in both samples:1 653 cm-1&1 621 cm-1(Ⅰ),1 555cm-1(Ⅱ) and 1 309 cm-1(Ⅲ),for initial extraction of maggot chitin;1 625 cm-1(Ⅰ),1 524 cm-1(Ⅱ),1 305 cm-1(Ⅲ),for further preparation of water-soluble chitin,respectively.The preparation of water-soluble chitin can be beneficial for the deep development and utilization of medicinal maggots.

Fly-maggot;Water soluble chitin;FTIR

TQ041+.7

A

2096-0387（2016）06-0004-04

2015年廣東省醫(yī)學科學技術研究基金項目（No.A2015040）。

李小波（1974-），男，博士，講師，研究方向：昆蟲生物活性物質研究。