包雍宏,吳 琛,王秀文,時(shí)文悅,宋元達(dá)
(山東理工大學(xué),山東淄博 255000)
甲殼素由N-乙酰氨基葡萄糖殘基經(jīng)過β-1,4 糖苷鍵聚合而成的線性多糖[1]。全球每年產(chǎn)生甲殼素約1 000億t,產(chǎn)量僅次于纖維素,是自然界中含量第二豐富的天然多糖,被現(xiàn)代科學(xué)譽(yù)為“第六生命要素”[2]。甲殼素主要存在于各種無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)中,包括海綿、軟體動(dòng)物、線蟲、節(jié)肢動(dòng)物和真菌等[3],它是保護(hù)和支持細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分,包裹覆蓋整個(gè)組織或生物體。甲殼素發(fā)現(xiàn)較早,可追溯到200 年前。法國學(xué)者Braconot[4]在1811 年從Agaricusvolvaceus、Hydnumrepandum等真菌中發(fā)現(xiàn)了同時(shí)含有氮和乙?;奈镔|(zhì)。Odier 在1823 年從甲殼類動(dòng)物的外殼中分離出具有相似性質(zhì)的物質(zhì),將其命名為“甲殼素”。甲殼素為白色或淡黃色片狀固體,其分子間的氫鍵作用很強(qiáng),具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性。甲殼素難溶于普通試劑,這嚴(yán)重限制了甲殼素的應(yīng)用,目前發(fā)現(xiàn)的較好的甲殼素溶劑有濃硫酸、濃鹽酸、濃磷酸、氫氟酸、濃NaOH、KOH 溶液和一些特殊的溶劑(如氯化鋰/N,N-二甲基乙酰胺、六氟異丙醇/六氟丙醇、三氟醋酸等)。
自然界中的甲殼素可被微生物降解成多糖,被其他生物利用,維持生態(tài)系統(tǒng)的碳氮循環(huán)。因此,甲殼素的降解代謝對(duì)全球的碳和氮循環(huán)具有重要意義,而維持這種循環(huán)離不開甲殼素降解菌和甲殼素酶。甲殼素酶(chitinase,EC 3.2.1.14)是一種可以專一性水解甲殼素為低分子糖的酶,主要作用于甲殼素中的β-1,4 糖苷鍵。1905 年,BENECKE 等[5]研究芽孢扦菌(Bacilluschitinovrous)分解甲殼素酶的過程中,首次發(fā)現(xiàn)并分離出一類糖苷水解酶,可催化水解甲殼素為N-乙酰氨基葡萄糖聚體或單體。隨著研究的深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)甲殼素酶廣泛分布于自然界中的真菌、細(xì)菌以及放線菌中,同時(shí)在昆蟲、甲殼類動(dòng)物、高等植物甚至病毒中都有發(fā)現(xiàn)。本文介紹了微生物甲殼素酶的分類和分布情況,總結(jié)了近年來微生物甲殼素酶的相關(guān)研究及其在不同行業(yè)的應(yīng)用前景。
甲殼素的生物降解系統(tǒng)與許多生物的生長和生存相關(guān)。對(duì)于不含甲殼素的細(xì)菌,甲殼素的生物降解系統(tǒng)可以為其提供碳源和氮源[6];對(duì)于以甲殼素為結(jié)構(gòu)支架的生物,甲殼素降解系統(tǒng)能夠降解甲殼素為其結(jié)構(gòu)組分的代謝提供原材料;對(duì)于一些含甲殼素的生物體,該系統(tǒng)還能夠幫助其抵抗很多病蟲的侵害[7]。
自然界中的甲殼素主要是由細(xì)菌降解的。細(xì)菌降解甲殼素主要包括三個(gè)步驟:分解結(jié)晶的甲殼素,將甲殼素鏈水解成二聚體,最后將二聚體水解成單體[8]。在細(xì)胞外環(huán)境中,前兩個(gè)步驟通常由裂解性多糖單氧酶(LPMO)、內(nèi)作用非加工性甲殼素酶和加工性甲殼素酶三種類型的酶催化。LPMO 在CAZy(碳水化合物活性酶)數(shù)據(jù)庫中被歸類為輔助活性(AA)10 和11 家族,可以通過氧化反應(yīng)切割結(jié)晶甲殼素表面的糖苷鍵,并引入氧化末端來促進(jìn)其他分泌性甲殼素酶進(jìn)一步降解甲殼素[9]。甲殼素酶通常會(huì)受到N-乙酰氨基葡萄糖胺(GlcNAc)的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié),這是甲殼素的水解產(chǎn)物,或甲殼素低聚物(GlcNAc)n,其中n=2~6。Miyashita 等[10]在研究中發(fā)現(xiàn),GlcNAc 可以作為鏈霉菌(Streptomyces)和擬桿菌(Paenibacillus)甲殼素酶表達(dá)的抑制物。圖1 顯示了甲殼素降解為低聚糖、殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺;而甲殼素多糖在細(xì)胞外被水解成單體或低聚合物后,產(chǎn)物會(huì)通過有效的攝取途徑進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)中,其中甲殼素低聚物會(huì)被β-N-乙酰己糖胺酶繼續(xù)水解為GlcNAc。同時(shí)在一些菌株中,磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)和ATP 結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體分別負(fù)責(zé)GlcNAc 單體和寡聚物的攝取[11-12]。
圖1 甲殼素降解為低聚糖(COG)、殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)Fig.1 Degradation of chitin to COG,chitosan and GlcNAc
研究發(fā)現(xiàn),不同甲殼素降解菌所產(chǎn)生的甲殼素酶的核苷酸序列具有高度保守性,例如粘質(zhì)沙雷氏菌、芽孢桿菌、霍亂弧菌等產(chǎn)生的甲殼素酶。這種現(xiàn)象被稱作遺傳保護(hù),可以解釋為單細(xì)胞中的多個(gè)基因在一個(gè)細(xì)胞中重復(fù),同時(shí),也有一些細(xì)菌產(chǎn)生的甲殼素酶的基因簇具有獨(dú)特的氨基酸序列。
甲殼素酶(chitinase,EC 3.2.1.14)是一種可以將甲殼素專一水解為低分子糖的酶(圖2),主要作用于甲殼素中的β-1,4 糖苷鍵。在CAZy 數(shù)據(jù)庫中,甲殼素酶歸屬于糖苷水解酶18 家族(GH18)和19 家族(GH19)以及20家族(GH20),它們?cè)诎被嵝蛄小⒋呋Y(jié)構(gòu)域以及蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)等方面具有較大差異。GH18 家族的甲殼素酶分布最為廣泛,在病毒、細(xì)菌、植物和動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)。而GH19 家族的甲殼素酶主要存在于植物中,但在細(xì)菌、病毒、線蟲中也有發(fā)現(xiàn)。根據(jù)序列的相似性,甲殼素酶可以被分為5 類(Ⅰ~Ⅴ)。第Ⅰ類甲殼素酶的催化結(jié)構(gòu)域最為保守,在N 端有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。第Ⅱ類與第Ⅰ類的催化結(jié)構(gòu)高度相似,但在N 端缺少一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)[13]。第Ⅲ類與前兩類沒有任何相似之處,第Ⅳ類甲殼素酶與第Ⅰ類相似,但由于缺失了四個(gè)催化結(jié)構(gòu)域,所以比第Ⅰ類要小很多。第Ⅴ類與其他任何一類甲殼素酶都沒有相似性。其中Ⅲ類和Ⅴ類甲殼素酶屬于GH18 家族,Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類屬于GH19 家族。GH18 家族甲殼素酶可以將甲殼素水解成較短的(GlcNAc)2和(GlcNAc)3片段,再經(jīng)由β-N-乙酰-D-己糖胺酶進(jìn)一步水解成單糖(GlcNAc)。GH18 家族還可進(jìn)一步分為甲殼素酶以及非酶活性的甲殼素酶樣凝集素和甲殼素酶樣蛋白質(zhì)。
圖2 甲殼素酶水解甲殼素類型Fig.2 Types of chitinase hydrolysis of chitin
按照產(chǎn)物和底物作用部位的不同,甲殼素酶又可被分為內(nèi)切甲殼素酶和外切甲殼素酶。迄今為止,內(nèi)切甲殼素酶主要來源于GH18 和GH19 兩個(gè)糖苷水解酶家族,而外切甲殼素酶主要來源于GH18 和GH20[9]。內(nèi)切甲殼素酶(EC 3.2.1.14)內(nèi)部任意位置開始水解甲殼素鏈,隨機(jī)生成GlcNAc 的低寡單位,如殼三糖、殼二糖和二乙酰殼二糖。外切甲殼素酶(EC 3.2.1.52)從甲殼素鏈的非還原端開始裂解甲殼素。外切甲殼素酶(EC 3.2.1.52)又被進(jìn)一步分為兩類,甲殼糖苷酶和β-N-乙酰-D-己糖胺酶。甲殼糖苷酶從甲殼素鏈的非還原端催化水解甲殼素并釋放出二乙?;鶜ざ?,β-N-乙酰-D-己糖胺酶則會(huì)將由內(nèi)切甲殼素酶水解產(chǎn)生的低聚GlcNAc 切割成GlcNAc 單體[14]。
甲殼素酶廣泛存在于各種病毒、昆蟲、植物和脊椎動(dòng)物中,并具有各種生理功能,如形態(tài)發(fā)生、致病、寄生和防御等[15]。在昆蟲和甲殼類動(dòng)物中,甲殼素酶的主要作用是在發(fā)育過程中分解舊角質(zhì)層以重塑外骨骼,從而保持和支撐生物的形體大小和形狀。對(duì)于一些以甲殼素為營養(yǎng)來源(如細(xì)菌)或以含有甲殼素的物質(zhì)為食物的生物(如脊椎動(dòng)物),甲殼素酶的主要功能是降解甲殼素提供碳源和能量。除此之外,甲殼素酶還參與拮抗作用。對(duì)于真菌而言,甲殼素酶不僅參與提供營養(yǎng),還在與真菌寄生相關(guān)的自溶和形態(tài)發(fā)生功能中起重要作用。由于甲殼素酶可以降解病原體的保護(hù)膜,所以對(duì)于植物而言,甲殼素酶可以保護(hù)其免受真菌感染以及病蟲危害,增強(qiáng)植物的抗性[16]。
在UniProt(蛋白序列)數(shù)據(jù)庫中,甲殼素酶具有3 967 個(gè)細(xì)胞生物蛋白質(zhì)序列、5 個(gè)病毒來源的蛋白質(zhì)序列和406 個(gè)亞基因組(https://www.uniprot.org/)。表1 對(duì)于目前已報(bào)道過的具有某些特征的微生物來源的甲殼素酶進(jìn)行了總結(jié)。由表知,自然界中,細(xì)菌是甲殼素的主要降解者。大多數(shù)細(xì)菌甲殼素酶屬于GH18 家族,主要來源于粘質(zhì)沙雷氏菌屬(Serratia marcescens)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)等。真菌來源的甲殼素酶同樣屬于GH18家族,子囊菌門的真菌是其主要來源。
表1 不同微生物來源的甲殼素酶Table 1 Chitinase from different microbial sources
大多數(shù)微生物甲殼素酶是誘導(dǎo)酶,只在甲殼素或甲殼素衍生物等底物誘導(dǎo)下才能合成甲殼素酶[40]。此外,微生物甲殼素酶還受一些營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響,其中營養(yǎng)因素包括碳、氮源以及一些有機(jī)鹽和無機(jī)鹽,環(huán)境因素包括溫度、pH、攪拌速度和發(fā)酵時(shí)間等。研究表明,微生物法制備甲殼素酶的最適溫度一般在28~30 ℃,最適初始pH 為5.0~9.0,底物濃度為1.5%~2.0%。國內(nèi)外研究證實(shí),不同菌株在發(fā)酵條件及抑制因素等方面存在較大的差異。
有研究人員使用“單因素法”對(duì)微生物培養(yǎng)基的成分和影響甲殼素酶生產(chǎn)的環(huán)境因素進(jìn)行了優(yōu)化,以提高其活性和分泌量。如Gomaa 等[41]在研究中使用膠體甲殼素和酪蛋白作為碳源和氮源,在30 ℃下培養(yǎng)了5d,使蘇云金桿菌(B.thuringiensis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)的甲殼素酶產(chǎn)量與活性大大提高。Alhasawi等[42]在將甲殼素粉末作為補(bǔ)料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),其中6 d 培養(yǎng)時(shí)間獲得的甲殼素酶產(chǎn)量最高。Sukalkar 等[14]通過研究發(fā)現(xiàn),大孢子鏈霉菌M1(Streptomyces macrosporeus)生產(chǎn)甲殼素酶的最佳培養(yǎng)基組成是膠體甲殼素、KNO3、CaSO4,最佳培養(yǎng)條件為pH 6,40 ℃、72 h,此條件下甲殼素酶的產(chǎn)量與對(duì)照組相比提高了2.62 倍。
野生型菌株甲殼素酶產(chǎn)量低、活性不高,這極大地限制了甲殼素資源的高效利用。因此,現(xiàn)階段關(guān)于甲殼素酶的研究重點(diǎn)在獲得更高的產(chǎn)量以及提高其催化活性上。除了利用分離培養(yǎng)和環(huán)境宏基因組學(xué)方法篩選新型甲殼素酶降解菌和甲殼素酶,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化外,結(jié)合外源表達(dá)和蛋白質(zhì)工程的實(shí)驗(yàn)方法也對(duì)闡明特定結(jié)構(gòu)或氨基酸殘基的功能、提高酶活性及產(chǎn)量提供了重要信息,并取得了一定進(jìn)展。
3.2.1 外源表達(dá)
外源表達(dá)是提高靶蛋白產(chǎn)量的有效策略。其中大腸桿菌(Escherichia coli)[43]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[44]及畢赤酵母(Pichia pastoris)[45]是甲殼素酶應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng),因?yàn)樗鼈兙哂猩L速度快、發(fā)酵周期短、易于遺傳操作、重組蛋白分泌能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Mengyan 等[46]采用一系列分子生物學(xué)方法提高了甲殼素酶在枯草芽孢桿菌DAU101 中的表達(dá),包括加入信號(hào)肽使甲殼素酶成功分泌到細(xì)胞外,進(jìn)一步優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)和間隔序列,以及結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)與定點(diǎn)突變技術(shù),將甲殼素酶的表達(dá)水平和比活力分別提高至51.67、249.62 U/mg。
3.2.2 蛋白質(zhì)工程
蛋白質(zhì)工程主要包括定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變和結(jié)構(gòu)域融合,是在已知甲殼素酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造和優(yōu)化的重要途徑。其中定向進(jìn)化是通過對(duì)易出錯(cuò)的PCR 進(jìn)行隨機(jī)突變,建立突變文庫,進(jìn)行高通量篩選,高效挑選出具有更高活性的突變體。Songsiriritthigul 等[47]利用該方法將地衣芽孢桿菌甲殼素酶的催化效率提高了2.7 倍。Kidibule等[45]通過定向進(jìn)化的方法獲得了甲殼素酶突變體并利用枯草芽孢桿菌作為外源表達(dá)系統(tǒng),獲得了高產(chǎn)胞外甲殼素酶工程菌株,其酶比活力最高提升了16.89 倍,達(dá)到(1 004.83±0.87)U/mg。
定點(diǎn)突變是一種提高甲殼素酶性狀的重要手段。Ni等[48]結(jié)合同源模擬、分子對(duì)接和定點(diǎn)突變,構(gòu)建了蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)甲殼素酶突變體,使突變體酶活性提高了60%以上,并表現(xiàn)出抗蟲和抗真菌活性。Emruzi 等[49]通過G191V 定點(diǎn)突變顯著提高了粘質(zhì)沙雷氏菌B4A 甲殼素酶的穩(wěn)定性,使其在50 ℃和60 ℃條件下,分別提高了約5、15 倍。
結(jié)構(gòu)域融合也是一種提高甲殼素酶活性的手段。結(jié)構(gòu)域融合通過增強(qiáng)甲殼素酶和底物的結(jié)合,從而提高其活性。Takashim 等[50]將GH18 催化域和N-末端LysM結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合,形成融合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,融合蛋白的甲殼素酶水解效率明顯高于單催化結(jié)構(gòu)蛋白。Neeraja等[51]將甲殼素酶催化域和CBM融合,提高了甲殼素酶對(duì)底物的親和性、酶活性和構(gòu)象穩(wěn)定性。
在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中,造成作物產(chǎn)量損失的重要因素之一是由細(xì)菌、真菌、昆蟲引起的疾病,其中真菌是植物病變的主要原因,占作物病害的70%以上。大多數(shù)植物病原菌的細(xì)胞壁主要成分是甲殼素,甲殼素酶可以通過控制真菌的孢子萌發(fā)以及菌絲體的生長來發(fā)揮其防御作用,因此被認(rèn)為是控制真菌病原菌最有效的制劑之一,被廣泛用于保護(hù)農(nóng)作物免受真菌感染侵害。如由蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生的甲殼素酶對(duì)引起馬鈴薯莖塊干腐的玫瑰鐮刀菌(Fusarium roseum)有明顯的抑制作用[52]。El-Shora 等[53]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)MN548732.1 產(chǎn)生的甲殼素酶對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、茄絲核菌(Rhizoctonia solani)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、米根霉(Rhizopus oryzae)和里氏木霉(Trichoderma reesei)有明顯的抑制作用。
農(nóng)業(yè)害蟲也是造成作物損失的重要因素,目前,化學(xué)農(nóng)藥殺蟲劑被廣泛用于控制農(nóng)業(yè)害蟲,然而化學(xué)農(nóng)藥毒性大,大量使用會(huì)污染環(huán)境,損害人類和其他生物的健康。生物殺蟲劑具有低毒性、生物降解性高、環(huán)境友好型等優(yōu)點(diǎn),其中微生物甲殼素酶是研究熱點(diǎn)。研究表明,甲殼素酶可以水解昆蟲幼蟲中腸圍食膜中的甲殼素成分,從而加速殺蟲劑侵染中腸上皮細(xì)胞,提高幼蟲的死亡率[54]。Suganthi 等[55]在其研究中發(fā)現(xiàn),由熒光假單胞菌(P.fluorescens)MP-13 產(chǎn)生的甲殼素酶對(duì)茶蚊(TMB)的致死率高達(dá)100%。
甲殼素酶可以作為制劑應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域,其可以與某些物質(zhì)或微生物整合并具有協(xié)同作用,表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑菌效果。目前,許多眼科制劑就是由甲殼素酶與微生物抑制劑合成。Halder 等[56]在研究中指出,抗真菌物質(zhì)與甲殼素酶整合可以有效治療多種真菌感染。Allonsius等[57]通過研究發(fā)現(xiàn),甲殼素酶與乳酸菌,特別是干酪乳酸菌(Lactobacillus casei)具有明顯的協(xié)同作用,可以有效抑制白色念珠菌(Candida albicans)的生長。此外,甲殼素酶還具有抗癌作用。Xing 等[58]在研究中發(fā)現(xiàn),來自灰鏈霉菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的甲殼素酶可以破壞小鼠的MCF-7 和B11-2 癌細(xì)胞。Abu-Tahon 等[59]發(fā)現(xiàn),綠色木霉(Trichoderma viride)AUMC13021產(chǎn)生的甲殼素酶對(duì)MCF7和HCT-116 細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,IC50值分別為20、40 μg/mL。
甲殼素酶因其良好的抑制真菌作用,可以用于食品保鮮,具有可行性高、節(jié)約成本、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。甲殼素酶能破壞真菌細(xì)胞壁,抑制孢子萌發(fā),從而延緩食物變質(zhì)。Le 等[60]發(fā)現(xiàn)鹽生弧菌(Salinivibriosp.)產(chǎn)生的甲殼素酶具有較高的抗真菌能力,且安全無害,可用于食品保鮮。Deng等[61]證實(shí)了來自哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的甲殼素酶能夠有效抑制灰曲霉(Botrytis cinerea)的生長,且對(duì)人體無害,可用于食品保鮮。從這些研究中可以得出,甲殼素酶能夠作為一種有效且有前途的食品貯藏保鮮物質(zhì)。
甲殼素酶和甲殼素材料還被廣泛用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。單細(xì)胞蛋白(SCP)是一種高價(jià)值的蛋白質(zhì)來源,可代替魚肉和豆粕成為新的蛋白質(zhì)來源。Tom 等[62]發(fā)現(xiàn)從黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)中分離出來的甲殼素酶可以水解甲殼素作為營養(yǎng)物質(zhì)用于畢赤酵母(Pichia kydriavzevii)發(fā)酵產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(45%蛋白質(zhì)和8%~11%核酸)。Vyas 等[63]用產(chǎn)自疣狀黏菌(Myrotheciumverrucaria)的甲殼素酶處理甲殼素,并將甲殼素水解物用作釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NCIM3052 生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白(SCP)的底物。
甲殼素酶是一類應(yīng)用前景廣闊的生物酶,能有效用于生物防治、醫(yī)藥化工及食品加工等領(lǐng)域?,F(xiàn)階段,自然分離的甲殼素酶存在活性低、熱穩(wěn)定性差,且甲殼素酶的純化過程繁瑣、產(chǎn)量低,缺乏大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的條件。但隨著在菌種選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化等方面的進(jìn)一步研究,同時(shí)隨著熱穩(wěn)定微生物甲殼素酶分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理和其基因水平調(diào)控機(jī)理研究的進(jìn)一步深入,微生物甲殼素酶終將實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的大規(guī)模生產(chǎn),應(yīng)用領(lǐng)域也將進(jìn)一步擴(kuò)大,并具有越來越廣闊的市場發(fā)展前景。