朱丹萍杜立中余加林艾　青肖　灑程　晨張云輝賀　雨潘　云宋思捷

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早產(chǎn)兒早期經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素對其腸道菌群的近期影響

朱丹萍1杜立中2余加林1艾青1肖灑1程晨1張云輝1賀雨1潘云1宋思捷1

摘要目的利用16S rDNA PCR及變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，探討生后經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素對早產(chǎn)兒早期腸道菌群的影響。方法以2014年1月至2015年1月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療的早產(chǎn)兒為研究對象，使用哌拉西林-他唑巴坦＞7 d為哌拉西林組，7 d內(nèi)未使用抗生素為對照組。收集胎糞(＜12 h)和3、5、7日齡(d3、d5、d7)的糞便標(biāo)本，采用PCR-DGGE方法對腸道菌群的變化行動態(tài)觀察，同時行克隆測序分析菌群組成的變化。結(jié)果24例早產(chǎn)兒的96份糞便標(biāo)本進入分析，哌拉西林組和對照組各12例，兩組基線具可比性。24份胎糞提取細(xì)菌DNA后行PCR擴增失敗，未行DGGE分析。①哌拉西林組d3、d5、d7時點的Shannon指數(shù)中位數(shù)(P(25)～P(75))分別為1.64(1.16～1.92)、1.97(1.69～2.20)和1.22(0.69～2.10) ;對照組分別為1.39(0.94～1.94)、2.24(2.07～2.49)和2.38(2.07～2.61)，哌拉西林組d7時點的Shannon指數(shù)顯著低于對照組(P＜0.05)。②隨日齡增加，對照組Shannon指數(shù)逐漸升高;哌拉西林組Shannon指數(shù)呈降低趨勢。③d7時點哌拉西林組和對照組均以克雷伯菌屬占絕對優(yōu)勢(35.5%和42.4%)，且乳酸桿菌屬檢出率均較低(1.6%和0.8%)。哌拉西林組較對照組腸球菌屬(21.0% vs 7.2%)及鏈球菌屬(25.8% vs 4.0%)比例明顯增加，腸桿菌比例明顯降低(3.2% vs 12.8%)。結(jié)論早產(chǎn)兒菌群結(jié)構(gòu)簡單，生后抗生素應(yīng)用會降低腸道菌群多樣性。

關(guān)鍵詞早產(chǎn)兒;腸道菌群;抗生素;變性梯度凝膠電泳

作者單位1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒中心，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，兒科學(xué)重慶重點實驗室，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地重慶，410014; 2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院杭州，310003

由于早產(chǎn)兒免疫功能不完善、對感染抵抗力差，且由于早發(fā)敗血癥診斷困難，常需要生后即開始經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素。而待血常規(guī)、CRP、降鈣素原、血培養(yǎng)等檢查除外早發(fā)敗血癥后，應(yīng)在48 h內(nèi)停用抗生素［1］。但由于早產(chǎn)兒產(chǎn)前常合并感染高危因素，且即便出現(xiàn)陰性的實驗室檢查結(jié)果，也不能完全排除早產(chǎn)兒感染，導(dǎo)致抗生素使用時間延長。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)驗性抗生素應(yīng)用時間延長與早產(chǎn)兒晚發(fā)敗血癥、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)的發(fā)生相關(guān)［2］，這一現(xiàn)象提示抗生素的長期使用是否會對早產(chǎn)兒腸道菌群產(chǎn)生影響，從而引起部分疾病的發(fā)生?目前尚未見相關(guān)研究。

1　方法

1.1研究設(shè)計以生后使用哌拉西林-他唑巴坦＞7 d的早產(chǎn)兒為哌拉西林組，生后7 d內(nèi)未使用抗生素的早產(chǎn)兒為對照組。采用16S rDNA PCR-DGGE及克隆測序技術(shù)對不同日齡糞便標(biāo)本行動態(tài)觀察，考察生后經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素對早期腸道菌群的影響。

1.2倫理和知情同意本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號: 109/2013)，且獲得患兒父母或法定監(jiān)護人的書面知情同意。

1.3早產(chǎn)兒經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素的指征存在感染危險因素(胎膜早破＞18 h，絨毛膜羊膜炎等)和臨床表現(xiàn)懷疑早期感染。

1.4哌拉西林組納入標(biāo)準(zhǔn)①出生后即轉(zhuǎn)運至我院治療的早產(chǎn)兒;②有經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素指征;③入院24 h內(nèi)應(yīng)用哌拉西林-他唑巴坦，且應(yīng)用＞7 d。

1.5對照組納入標(biāo)準(zhǔn)①出生后即轉(zhuǎn)運至我院治療的早產(chǎn)兒;②無經(jīng)驗性抗生素治療指征;③生產(chǎn)方式、胎齡［3］與哌拉西林組盡量匹配。

1.6排除標(biāo)準(zhǔn)兩組均排除，①臨床需要使用微生態(tài)制劑，②存在敗血癥、先天畸形、先天異?；蜻z傳代謝性疾病者。

1.7標(biāo)本采集方法及時點使用一次性無菌糞便采集管收集早產(chǎn)兒出生后胎糞(＜12 h)及3、5、7日齡(d3、d5、d7)時點的糞便標(biāo)本，稱量250 mg糞便置于1.5 mL無菌EP管中，并于收集后2 h內(nèi)凍存于－80℃冰箱中。

1.8糞便細(xì)菌DNA提取將凍存的糞便標(biāo)本置于冰上，按照QIAamp FAST DNA stool Mini Kit試劑盒(QIAGEN，德國)說明提取細(xì)菌DNA，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9PCR-DGGE

1.9.1PCR擴增參照課題組前期的方法，使用細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的通用引物進行擴增［2］。因標(biāo)本細(xì)菌DNA量少，改良PCR辦法為降落PCR，反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃30 s; 61～56℃，每循環(huán)降低0.5℃30 s，72℃ 1 min，10個循環(huán); 94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25個循環(huán); 72℃延伸7 min，2%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。

1.9.2PCR產(chǎn)物行DGGE根據(jù)課題組前期建立的方法［2，3］，采用BIO-RAD Dcode Universal Mutation System進行電泳分析，觀察并記錄凝膠條帶，同時對優(yōu)勢條帶切割回收。DGGE圖譜使用Quantity one軟件分析，得出條帶豐富度(S)，其越大代表檢測到菌種數(shù)量越多。采用多樣性數(shù)據(jù)分析軟件(BIO-DAP)計算Shannon指數(shù)(H')，細(xì)菌種類越豐富Shannon指數(shù)越大［4］。

1.10條帶回收、克隆、測序切割回收的膠條經(jīng)清洗后，用30 μL滅菌去離子水浸泡12～16 h得到DNA液，用不含“GC”夾的引物:上游357f (5'-CCTACGGAGGCAGCAG-3')和下游518r(同上)行PCR擴增，所得產(chǎn)物用TaKaRa膠回收試劑盒進行純化、回收(步驟參照相應(yīng)說明書)，行T-A克隆后，送上海生物工程有限公司測序，測序結(jié)果在Blast上進行比對，分析細(xì)菌種類。

1.11統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗;非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗;計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況2014年1月至2015年1月我院住院治療的24例早產(chǎn)兒的96份糞便標(biāo)本納入分析，哌拉西林組和對照組各12例，平均胎齡分別為(34.3±1.2)和(34.4± 1.4)周;兩組男性均為4例;出生體重分別為(2.2±0.4) 和(2.3±0.5) kg;兩組剖宮產(chǎn)均為10例;出生后均采用人工喂養(yǎng)，兩組基線數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2DGGE圖譜多樣性分析24份胎糞標(biāo)本提取細(xì)菌DNA后行PCR擴增失敗，故未行DGGE分析。其余3個時點(d3、d5、d7) 72份糞便標(biāo)本經(jīng)分析得到DGGE圖譜(圖1)。其中哌拉西林組d5、d7時點的條帶數(shù)低于對照組(d5: 90 vs 119條; d7: 62 vs 125條)，d3時點的條帶數(shù)哌拉西林組和對照組分別為62和61條。

哌拉西林組d3、d5、d7時點的條帶豐富度中位數(shù)(P25，P75)分別為5.50(3.50～7.00)、7.50(5.75～9.25)和3.50 (2.00～8.25)，對照組分別為4.50(2.75～7.25)、10.00 (8.00～12.25)和11.00(8.00～14.00)，其中d7時點條帶豐富度哌拉西林組顯著低于對照組(Z =－3.229，P = 0.001)，d3、d5時點條帶豐富度兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

哌拉西林組d3、d5、d7時點的Shannon指數(shù)中位數(shù)(P25，P75)分別為1.64(1.16～1.92)、1.97(1.69～2.20)和1.22(0.69～2.10)，對照組分別為1.39(0.94～1.94)、2.24(2.07～2.49)和2.38(2.07～2.61)，其中d5時點的Shannon指數(shù)哌拉西林組略低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z =－1.850，P = 0.068)，d7時點的Shannon指數(shù)顯著低于對照組(Z =－3.133，P =0.001)。

隨日齡增加，對照組Shannon指數(shù)逐漸升高;哌拉西林組Shannon指數(shù)呈降低趨勢，d7時點Shannon指數(shù)低于d3時點水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1　哌拉西林組與對照組在3、5、7日齡時點的糞便細(xì)菌DNA 16S rDNA PCR-DGGE結(jié)果

2.3細(xì)菌種屬組成分布對d7時點的DGGE圖譜(圖1)的條帶行細(xì)菌種類分析，切膠回收優(yōu)勢細(xì)菌片段序列在Blast上比對分析顯示，序列一致性達95%～100%，結(jié)果如表1及表2所示。其中哌拉西林組62個條帶共檢測出無法培養(yǎng)及可培養(yǎng)的5個菌屬，對照組125個條帶共檢測出無法培養(yǎng)及可培養(yǎng)的7個菌屬。表3顯示，兩組均以克雷伯菌屬占絕對優(yōu)勢，哌拉西林組和對照組分別為35.5%和42.4%;乳酸桿菌屬檢出率較低，哌拉西林組和對照組分別為1.6%和0.8%;與對照組相比，哌拉西林組腸球菌屬及鏈球菌屬比例明顯增加(P＜0.05)，腸桿菌比例明顯降低(P＜0.05)，未檢測到韋榮球菌屬及梭菌屬。

表1　哌拉西林組DGGE膠回收測序?qū)Ρ冉Y(jié)果

表2　對照組DGGE膠回收測序?qū)Ρ冉Y(jié)果

3　討論

腸道菌群在人體健康中的作用十分重要，與營養(yǎng)吸收及代謝、免疫系統(tǒng)維護息息相關(guān);同時菌群失衡亦與許多疾病相關(guān)，如Ⅰ型糖尿病、過敏及肥胖等［5］。在新生兒期，腸道菌群處于動態(tài)變化的特殊時期，其定植和構(gòu)成不僅受到胎齡、生產(chǎn)方式和喂養(yǎng)方式等因素影響，還與接受的治療有關(guān)［6］。早產(chǎn)兒易受病原體感染，故臨床上因不能除外敗血癥，常在早產(chǎn)兒生后給予經(jīng)驗性抗生素治療。

表3　細(xì)菌種屬組成構(gòu)成比［n(%)］

早產(chǎn)兒早期感染常由大腸埃希菌等革蘭陰性菌引起［7，8］，但也不能完全除外革蘭陽性菌，故常選擇針對革蘭陰性菌的廣譜抗生素如哌拉西林-他唑巴坦經(jīng)驗性治療，本研究也選擇該藥探討其對早產(chǎn)兒早期腸道菌群的影響，結(jié)果顯示哌拉西林組3 d內(nèi)對菌群多樣性影響較小，7 d時點腸道菌群多樣性明顯低于對照組，且腸道細(xì)菌的種類也有明顯差異，提示隨抗生素使用時間延長，其對腸道菌群的影響明顯。同時觀察到隨日齡的增加，對照組腸道菌群多樣性呈升高趨勢，而使用抗生素早產(chǎn)兒菌群多樣性有降低趨勢，提示抗生素會導(dǎo)致腸道菌群的種類減少。Greenwood等［9］研究報道，極低出生體重兒經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素會導(dǎo)致其生后1月齡時菌群多樣性的降低，與本文結(jié)果類似。且有研究發(fā)現(xiàn)菌群多樣性的降低可能與NEC發(fā)生相關(guān)［10］，生后經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素也與早產(chǎn)兒NEC及晚發(fā)敗血癥的發(fā)生相關(guān)［2］。提示經(jīng)驗性使用抗生素后，應(yīng)在確認(rèn)排除感染后及時停用，以減輕其對腸道菌群的影響。

本研究結(jié)果顯示，克雷伯菌屬在早產(chǎn)兒糞便菌群中占主要地位，與Schwiertz等［11］和唐小麗等［12］研究結(jié)果一致。對比哌拉西林組和對照組的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，腸球菌屬及鏈球菌屬在哌拉西林組的比例明顯高于對照組，這可能是由于抗生素的選擇作用所致。腸球菌細(xì)胞壁堅厚，對許多抗菌藥物大多表現(xiàn)為固有耐藥，加之多數(shù)鏈球菌為致病菌，抗生素可將腸道內(nèi)共生菌殺滅，從而導(dǎo)致了上述耐藥細(xì)菌及致病菌的過度生長。對照組由于沒有抗生素的作用，其細(xì)菌種類相對較多，韋榮球菌屬及梭菌屬均有檢測到。

益生菌被認(rèn)為是定植在腸道內(nèi)對機體有益的微生物，有研究表明益生菌制劑可降低早產(chǎn)兒NEC的發(fā)生率［13］，出生后隨著需氧菌的定植消耗腸道內(nèi)的氧氣，才使得益生菌等厭氧菌得以生存，腸道內(nèi)常見的益生菌主要是乳酸桿菌及雙歧桿菌，且雙歧桿菌在腸道內(nèi)的出現(xiàn)與胎齡相關(guān)，多出現(xiàn)在≥33周早產(chǎn)兒中［14］。本研究中未檢測到雙歧桿菌，乳酸桿菌也僅在2例＞34周的早產(chǎn)兒出現(xiàn)，但由于例數(shù)太少，無法推斷其與胎齡的關(guān)系。本研究益生菌檢出率低，可能與早產(chǎn)兒腸道功能不成熟、細(xì)菌定植延遲有關(guān)。

本研究胎糞標(biāo)本經(jīng)細(xì)菌通用引物多次PCR失敗，表明其中細(xì)菌存在較少，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，出生時腸道內(nèi)是無菌的，出生后周圍環(huán)境及母親的細(xì)菌迅速在腸道定植，但Mshvildadze等［10］發(fā)現(xiàn)胎糞中也有細(xì)菌的存在，認(rèn)為其來源于子宮。同時有研究［15］通過糞便培養(yǎng)的辦法在≤32周早產(chǎn)兒自然排出的胎糞標(biāo)本中也檢測到桿菌及厚壁菌門，其中葡萄球菌屬占主要地位。上述研究與本研究結(jié)果差異較大，可能主要是不同方法檢驗敏感度不同所致。

本研究的不足之處:僅收集到早產(chǎn)兒生后1周內(nèi)糞便標(biāo)本，無法判斷抗生素對菌群的長期影響。

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(本文編輯:丁俊杰)

Effect of initial empirical antibiotic treatment on the intestinal microbiota of preterm infants

ZHU Dan-ping1，DU Li-zhong2，YU Jia-lin1，AI Qing1，XIAO Sa1，CHENG Chen1，ZHANG Yun-hui1，HE Yu1，PAN Yun1，SONG Si-jie1(1 Department of Neonatology，Children' s Hospital of Chongqing Medical University; Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders; Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing; Chongqing International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders，Chongqing 410014，China; 2 The Children's Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310003，China)
Corresponding Author: YU Jia-lin，E-mail: yujialin486@126.com

AbstractObjective To analyze the effect of empirical antibiotic therapy on the intestinal microbiota of preterm infants and its dynamic change by 16S rDNA PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).Methods In the period from January 2014 to January 2015，twenty-four hospitalized preterm infants in Children's Hospital of Chongqing Medical University were enrolled and divided into piperacillin-tazobactam treatment (PT) group and antibiotic free (AF) group.The meconium and fecal samples on d3，d5 and d7 were collected during the first week of life.After DNA extraction and PCR amplification，the microbial community diversity was analyzed through DGGE fingerprints.The distributions of common dominant bacteria were investigated by TA cloning and sequencing.Results A total of 96 fecal samples were analyzed.The amplification of bacterial DNA from 24 meconium(＜12 h) was failed and DGGE analysis was not performed.①The median (P(25)－P(75)) of Shannon index of PT group on d3，5 and 7 was 1.64 (1.16－1.92)、1.97 (1.69－2.20) and 1.22 (0.69－2.1) respectively，and that of AF group at the same time point was 1.39 (0.94－1.94)、2.24 (2.07－2.49) and 2.38 (2.07－2.61).On d3 and d5 of postnatal life，PT and AF infants did not differ in the diversity index of the fecal bacterial community，but on d7，the Shannon index of PT group was significantly lower than that of the AF group(P＜0.05).②The result of DGGE at all the 3 time points showed that the Shannon index of AF group gradually increased during the first week of life，while the Shannon index of PT group had a tendency of decrease.③The bacterial composition on day 7 from DGGE fingerprint showed that Klebsiella sp.was dominant (35.5% and 42.4%) and the proportion of lactobacillus sp.was low (1.6% and 0.8%) in both groups.The proportions of Enterococcus sp.and Streptococcus sp.in PT group were higher (21.0% vs 7.2%，25.8% vs 4.0%)，while the proportion of Enterobacter sp.was lower than that of AF group (3.2% vs 12.8%).Veillonella sp.and Clostridium sp.could only be detected in the AF group.Conclusion The gutbook=27,ebook=30microbiota of preterms has a simple structure.The antibiotic therapy can reduce the diversity.

Key wordsPreterm infant; Gut microbiota; Antibiotic; Denaturing gel gradient electrophoresis

(收稿日期:2015-10-30修回日期: 2016-01-16)

通訊作者余加林，E-mail: yujialin486@126.com

基金項目國家自然科學(xué)基金: 81370744，81571483;“十二五”國家科技支撐計劃項目之課題五: 2012BAI04B05

DOI:10.3969/j.issn.1673-5501.2016.01.007