蜂膠與葡萄柚提取物混合液對(duì)變形鏈球菌作用的體外研究①

楊清嶺，項(xiàng)劍虹，俎紅偉

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童牙病科，黑龍江佳木斯154002)

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蜂膠與葡萄柚提取物混合液對(duì)變形鏈球菌作用的體外研究①

楊清嶺，項(xiàng)劍虹，俎紅偉

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童牙病科，黑龍江佳木斯154002)

摘要:目的:探討葡萄柚提取物(GSE)、蜂膠這兩種天然提取物配伍使用時(shí)在防齲方面的可行性，即期望通過(guò)兩種天然提取物的配伍應(yīng)用，達(dá)到降低單組分使用時(shí)的使用劑量和副作用。方法:采用液體稀釋法。分別測(cè)定蜂膠、葡萄柚提取物以及兩者混合溶液的MIC，進(jìn)而通過(guò)分級(jí)抑制濃度指數(shù)，來(lái)判斷混合液對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)作用的影響。結(jié)果:①通過(guò)分級(jí)抑制濃度指數(shù)計(jì)算表明，兩藥物聯(lián)用對(duì)變形鏈球菌的抑制作用是相加作用。②混合藥液對(duì)變形鏈球菌黏附抑制率取決于混合液濃度的變化呈正相關(guān)。③變形鏈球菌培養(yǎng)前后△pH值隨著蜂膠與葡萄柚提取物混合液的濃度增加而顯著降低。結(jié)論:將兩藥混合使用能降低各組分藥物的使用濃度;兩藥物混合液在一定濃度范圍能有效抑制變形鏈球菌對(duì)光滑玻璃表面的黏附;混合液可抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸(［1］)。

關(guān)鍵詞:蜂膠;葡萄柚;變形鏈球菌;抑制;黏附;產(chǎn)酸;正相關(guān)

GSE是一種天然提取物，是一種廣譜抑菌類化合物，高效且很有發(fā)展?jié)摿?，殺菌在非常低的濃度時(shí)就可取得顯著的效果。蜂膠具有毒副作用?。?］、抑菌效果好的特點(diǎn)。本研究進(jìn)一步探究蜂膠和葡萄柚提取物配伍混合液的抗菌機(jī)制，為兩者混合液能夠應(yīng)用于臨床上防治齲病提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑

(1)變形鏈球菌ATCC 25175:購(gòu)于杭州百思生物［3］。(2)蜂膠(水溶性固體，純度98%) :購(gòu)于西安森卓生物科技。(3) TPY液體培養(yǎng)基(1.5%胰蛋白胨、1%葡萄糖、0.6% KH2PO4、0.4%酵母提取物、0.2% K2HPO4·3H2O、0.2% Na2CO3、0.2% NaCl，pH7.0) :青島海天化玻。(4) TPY瓊脂培養(yǎng)基(含1.25%瓊脂的TPY液體培養(yǎng)基) :青島海天化玻。(5)葡萄柚提取物:廣州文玲貿(mào)易有限公司。(6)磷酸鹽PBS緩沖液:實(shí)驗(yàn)室配置。(7)生理鹽水等。(8)漱爽復(fù)方氯已定含漱液(含0.12%葡萄糖酸氯已定) :購(gòu)于哈爾濱樂(lè)泰藥液。

1.2藥液的制備

(1) TPY液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的配制:稱取TPY液體培養(yǎng)基2.64g和4.64g，分別加入100mL蒸餾水。高壓滅菌20min，備用。(2) PBS磷酸鹽緩沖液的配制:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.24g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 1.44，氯化鈉(NaCl) 8g，氯化鉀(KCl) 0.2g，吐溫－20，加水。調(diào)pH 7.2，定容1L，備用。

1.3菌液的制備

將S.m接種于液體TPY培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，然后用離心機(jī)以3500r/min離心15min，棄上清液，PBS緩沖液沖洗菌液2次，加入裝有無(wú)菌液體TPY培養(yǎng)基試管中，調(diào)節(jié)菌液濃度為D(630) = 1.0，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整其濁度為至0.5麥?zhǔn)蠞舛?細(xì)菌近似濃度為1.5×108個(gè)菌/mL)。

1.4藥液制備、分組

蜂膠母液制備:取一定量的固體水溶性蜂膠放入無(wú)菌液體TPY中，配制成濃度為100mg/mL蜂膠母液，備用［4］。

實(shí)驗(yàn)組:用37℃預(yù)熱的TPY液體培養(yǎng)基將蜂膠母液倍比配置成750.00000、375.00000、187.50000、93.75000、46.87500 mg / L共5個(gè)濃度組。陽(yáng)性對(duì)照組:分別用37℃預(yù)熱的TPY液體培養(yǎng)基和氯已定1mL充分混勻后，取出1mL混合物加入50 μL菌液。陰性對(duì)照組:加入菌液50μL和TPY液體培養(yǎng)基1mL?？瞻讓?duì)照組:只含TPY液體培養(yǎng)基1mL。每組各濃度均設(shè)置5個(gè)重復(fù)管。

1.5測(cè)定葡萄柚提取物和蜂膠單組份各自的MIC值

用MTT比色法分別測(cè)定蜂膠、葡萄柚提取物各濃度組的OD值［5］，計(jì)算抑菌率。每組均加入100μL的1×108CFU/mL菌懸液，陽(yáng)性對(duì)照組加入0.12%氯已定和菌液各100μL，陰性對(duì)照組TPY培養(yǎng)基和菌液各100μL，空白對(duì)照組只加200μLTPY培養(yǎng)基。用比濁法觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，其中細(xì)菌不生長(zhǎng)的最小濃度即為抑制變鏈菌生長(zhǎng)的最小抑菌濃度。上述測(cè)定過(guò)程重復(fù)3次，取均值。

1.6確定蜂膠、葡萄柚提取物混合液的MIC值

通過(guò)MTT比色法測(cè)定蜂膠、葡萄柚提取物各濃度組混合液的OD值，在96孔板橫排分別加入0.75000、0.37500、0.18750、0.09375、0.046875mg / mL蜂膠溶液100μL，縱排加入0.37500、0.18750、0.09375、0.04688、0.02344mg/mL葡萄柚提取物溶液100μL，將兩溶液混合均勻，每孔分別加入已備好的菌液20μL。PBS洗滌后棄液，各孔再加入100μL 的TPY液體培養(yǎng)基和10μL MTT，然后加入150μL DMSO溶液，在搖床上振蕩10min。測(cè)量出光密度值，計(jì)算出抑菌率達(dá)到80%時(shí)混合液的最小濃度，上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)3次［6］。

1.7混合液抑菌效果的評(píng)估指標(biāo)

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，可計(jì)算出分級(jí)抑制濃度指數(shù)，進(jìn)而判定兩者的抗菌作用關(guān)系。

1.8葡萄柚－GSE對(duì)S.m黏附的影響

實(shí)驗(yàn)方法如下:取20個(gè)5mL玻璃試管，分成5組，每組四個(gè)試管平行對(duì)照［7］，加入制備好的TPY液體培養(yǎng)基2mL、菌懸液0.1mL、0.25mLPBS緩沖液(5%蔗糖－0.5mol/L)，加入0.05mL對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組溶液，放置于37℃厭氧培養(yǎng)箱24h，各試管與地面呈30°角培養(yǎng)。24h后將試管中的溶液緩慢移除，再用蒸餾水洗脫黏附在試管壁的細(xì)菌，反復(fù)洗滌3次，然后用離心機(jī)離心20min。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A550nm。

1.9葡萄柚－GSE對(duì)S.m產(chǎn)酸能力的影響

用二倍稀釋法制備以下四個(gè)混合液濃度: 0.5、0.25、0.125、0.0625MIC(設(shè)空白對(duì)照組)，將pH值調(diào)定為7.4，按菌液與藥物混合液1: 10(v/v)接種S.m，在37℃厭氧箱培養(yǎng)24h，離心20min，取上層清液，測(cè)定pH值，重復(fù)3次，取均值，計(jì)算△pH:△pH=起始pH－離心后pH［8］。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用單因素方差對(duì)各組總體均數(shù)之間進(jìn)行分析比較(Analysis of variance)。

2　結(jié)果

2.1變鏈菌在不同濃度蜂膠溶液和GSE溶液中的抑制情況見(jiàn)表1～2。

表1　不同濃度蜂膠溶液對(duì)S.m的抑制情況

表2　不同濃度GSE對(duì)S.m的抑制情況

由以上二表可判定，蜂膠MIC值為0.37500mg/mL，GSE的MIC值為0.04688mg/mL。

2.2不同濃度GSE溶液和蜂膠溶液混合液抑制變鏈菌的情況

見(jiàn)表3，由表中數(shù)據(jù)計(jì)算出分級(jí)抑制濃度指數(shù):蜂膠與GSE聯(lián)用時(shí)，其MIC值為0.09375mg/mL，GSE與蜂膠聯(lián)用時(shí)，其MIC值為0.04688mg/mL，可得FICI =0.82。表明蜂膠與GSE聯(lián)用時(shí)為相加作用。

表3　蜂膠－GSE混合液抑制S.m光密度值(±s)

表3　蜂膠－GSE混合液抑制S.m光密度值(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較

GSE(mg/ml)蜂膠(mg/mL) 〗0.37500　0.18750　0.09375　0.04688 0.37500　0.237±0.07＊　0.244±0.02＊　0.249±0.09＊　0.799±0.03＊0.18750　0.252±0.02＊　0.306±0.11＊　0.363±0.10＊　0.813±0.12＊0.09375　0.301±0.14＊　0.327±0.05＊　0.802±0.04＊　0.890±0.04＊0.04688　0.325±0.09＊　0.340±0.16＊　0.924±0.02＊　0.981±0.13＊0.02344　0.670±0.18＊　0.917±0.01＊　0.975±0.03＊　1.002±0.01＊陽(yáng)性對(duì)照　0.305陰性對(duì)照　1.584空白對(duì)照0.108

2.3混合液對(duì)S.m黏附作用的影響

從表中可看出隨著混合液濃度的增加，變形鏈球菌的黏附抑制率逐漸升高［9］。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組各濃度組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組各濃度組間也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表4　　蜂膠－GSE混合液對(duì)S.m黏附的影響(±s)

表4　　蜂膠－GSE混合液對(duì)S.m黏附的影響(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較.

混合液濃度　1/16MIC　1/8MIC　1/4MIC　1/2MIC　　空白對(duì)照(TPY) 0.258±0.013黏附抑制率(%)吸光度值　0.236±0.027　0.210±0.014　0.178±0.012　0.147±0.090＊10.28　19.49　34.36　47.54　　－

2.4混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸能力的影響

結(jié)果顯示:隨混合液濃度的增加S.m的產(chǎn)酸能力明顯降低。各濃度組與陰性對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表5　蜂膠－GSE混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸的影響(±s)

表5　蜂膠－GSE混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸的影響(±s)

＊P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較。

混合液濃度　0.0625MIC　0.125MIC　0.25MIC　0.5MIC　　空白對(duì)照(TPY) .0202　3.27±0.0215 △pH值　3.23±0.0198　3.18±0.0217　3.05±0.0245　2.81±0

3　討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定蜂膠MIC值為0.37500mg/mL，GSE的MIC值為0.04688mg/mL，GSE與蜂膠聯(lián)用時(shí)，其MIC值為0.04688mg/mL，蜂膠與GSE聯(lián)用時(shí)，其MIC值0.09375mg/mL，根據(jù)公式計(jì)算得FIC =0.82。這表明蜂膠與GSE聯(lián)用時(shí)為相加作用［10］。本實(shí)驗(yàn)還觀察了蜂膠和GSE混合液對(duì)S.m產(chǎn)酸的作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著混合液濃度的增加，S.m的△pH值降低，濃度為1/16MIC時(shí)抑制產(chǎn)酸能力最弱，濃度為1/2MIC △pH最小，其表明此時(shí)產(chǎn)酸量降低，抑制產(chǎn)酸能力增強(qiáng)。說(shuō)明混合液能明顯抑制S.m產(chǎn)酸［11］。

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(收稿日期:2015－03－17)

通訊作者:項(xiàng)劍虹(1967～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生，副主任醫(yī)師。E－mail: xiangjianhong1967@163.com。

作者簡(jiǎn)介:①楊清嶺(1962～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

中圖分類號(hào):R378.1+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

文章編號(hào):1008－0104(2016) 02－0075－02