郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

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不同凍存液對無血清BHK21細胞冷凍效果的影響

郭海平 李培林 趙子紅 哈申高娃 郭冠萍/金宇保靈生物藥品有限公司

在細胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛用于科學(xué)研究領(lǐng)域的今天，細胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇這一基礎(chǔ)技術(shù)日益得到重視。冷凍保存是細胞長期保存的唯一方法，有利于減少細胞被微生物污染和細胞之間交叉污染的危險性，減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變以及避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。大多數(shù)的細胞若無特別的要求，都可冷凍保存于-130℃以下長達多年。動物細胞冷凍保存，為細胞培養(yǎng)工作帶來很大的機動靈活性，降低了人力和物力的消耗。但是細胞經(jīng)冷凍以后，復(fù)蘇后的活力始終是細胞工作者最關(guān)心的問題之一，怎么樣才能保證細胞在凍存的過程中受到的損傷最小？怎么樣才能使細胞復(fù)蘇后的活力以及細胞形態(tài)與冷凍之前的差異最小？這一直是我們努力的方向。近年來，培養(yǎng)基的發(fā)展很迅速，從正常血清到低血清的培養(yǎng)基，現(xiàn)在已經(jīng)推出了無血清培養(yǎng)基甚至是CD培養(yǎng)基，相應(yīng)就會有低血清細胞，以及無血清細胞。血清在細胞的生長過程中起到了很重要的作用，有很多未知的成分對細胞有重要的影響。而體外培養(yǎng)的細胞在無血清的培養(yǎng)基中，非常脆弱，對各種因素十分敏感，那么在無血清細胞的凍存過程中，怎樣能保證細胞的最高活力，這是一個新的課題。有很多的因素會影響解凍后的細胞的存活率，例如細胞的冷凍密度、凍存液的配方以及冷凍程序，細胞的解凍溫度等都會對細胞的凍存效果有影響。本實驗就凍存液的配方對無血清BHK21細胞活力的影響做了分析，這將會在生產(chǎn)中有一定的指導(dǎo)意義。

一、材料

1.細胞株。BHK21細胞來自金宇保靈生物藥品有限公司。

2.試劑。培養(yǎng)液購自CIBCO公司；新生牛血清購自內(nèi)蒙古維克生生物科技有限公司；甲基纖維素購自天津博迪化工股份有限公司；臺盼藍購自SIGMA公司；DMSO （D2650）購自SIGMA-ALDRJCH 公司。

3.其它實驗器材和儀器。超凈工作臺(YJ-1450)購自吳江市江南凈化工程有限公司；離心機（DL-5-B）購自上海安亭科學(xué)儀器廠；冰箱（SC-276）購自青島海爾電冰柜有限公司；倒置顯微鏡（CKX41）OLYMPUS；液氮罐（YDS-30-125F）購自樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司；50 ml離心管，凍存管購自corning公司；移液器購自芬蘭雷伯；鑷子、防凍手套、防護面罩、血球計數(shù)板、經(jīng)校驗的溫度計均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

二、方法

用對照、實驗1和實驗2三種不同的凍存液凍存同一批細胞，在細胞凍存半年后同時進行復(fù)蘇，每種凍存的細胞復(fù)蘇2支，檢驗凍存效果，計算復(fù)蘇活力。重復(fù)進行三次凍存實驗。

1.凍存液的配制。對照凍存液：7.5％ DMSO，92.5％培養(yǎng)液；實驗1凍存液：7.5％ DMSO，10％血清，82.5％培養(yǎng)液；實驗2凍存液：7.5％ DMSO，10％甲基纖維素，82.5％培養(yǎng)液。

2.細胞的離心。取對數(shù)生長期的細胞，倒入離心管中離心900 r/m，5 min。

3.細胞的分裝及凍存。細胞離心后，棄上清，用已經(jīng)配制好的3種凍存液重懸細胞，然后分裝入凍存管中，每管1.5 ml。按以下程序進行凍存：4℃放置1 h，-20℃放置2 h，液氮口放置0.5 h，放入液氮中。

4.細胞復(fù)蘇。細胞凍存半年后進行復(fù)蘇，每種細胞復(fù)蘇2支，計算其平均活力。從液氮中取出凍存管直接放入37℃溫水中，并不時搖動使其在1～2 min內(nèi)盡快融化。融化后離心720 r/m，5 min，棄上清，每支管中加入1 ml培養(yǎng)液，計數(shù)，計算其活力。細胞計數(shù)：4大格細胞總數(shù)÷4×104×稀釋倍數(shù)。細胞活力=活細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100％。

三、結(jié)果與分析

1.凍存前細胞的密度和活力。結(jié)果見表1，三次試驗的細胞的活力都在95％以上，符合凍存標(biāo)準(zhǔn)。

表1　凍存前細胞的密度和活力

2.復(fù)蘇后細胞的密度和活力。結(jié)果見表2。

表2　復(fù)蘇后細胞的密度和活力

表2結(jié)果顯示，共進行了三次凍存實驗，從復(fù)蘇活力的平均值來看，對照的復(fù)蘇活力三次都是最低的，其中的1次低于90％，而實驗1和實驗2的復(fù)蘇活力均比對照的高，均在90％以上，而且實驗1的復(fù)蘇活力是最高的。

四、討論

細胞凍存在細胞培養(yǎng)中是一個非常重要的環(huán)節(jié)，細胞凍存效果的好壞直接影響細胞復(fù)蘇后的成活率以及后期的繁殖。尤其是對于無血清BHK21細胞的凍存，無血清的細胞非常脆弱，很容易受到外界因素的影響。本文就不同配方的凍存液來凍存無血清BHK21細胞，復(fù)蘇后檢驗其復(fù)蘇活力，進行了三次平行試驗，結(jié)果顯示，含有血清和甲基纖維素的凍存液凍存的細胞，復(fù)蘇后的復(fù)蘇活力比對照高?？赡苁怯捎谠诩毎膬龃孢^程中，血清和甲基纖維素起到了一定的保護作用，減少了細胞在凍存過程中受到的損傷，因此表現(xiàn)出細胞的復(fù)蘇活力高。因此建議在無血清BHK21細胞的凍存中，凍存液中最好添加血清或甲基纖維素，以提高保護性能。

在本實驗中，涉及到了很多需要細胞計數(shù)的工作，但是實驗中的所有數(shù)據(jù)都是人工計數(shù)得出，可能存在人為誤差，對實驗結(jié)果有一定影響，但是由于數(shù)據(jù)都是由固定的人員來做的，可能對實驗結(jié)果影響不大，需要以后繼續(xù)開展實驗，累積數(shù)據(jù)。

五、小結(jié)

本實驗比較分析了3種不同配方的凍存液對無血清BHK21細胞凍存效果的影響，發(fā)現(xiàn)添加血清的凍存液在細胞凍存的過程中比其它2種凍存液有更好的保護效果。

參考文獻(略)

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