王曉茹 ，白光輝(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 5009；蘇州市立醫(yī)院)

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胃腸道間質(zhì)瘤淋巴管及血管生成機(jī)制

王曉茹1，白光輝2(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2蘇州市立醫(yī)院)

摘要：目的探討胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)的淋巴管及血管生成機(jī)制。方法 收集70例GIST患者的腫瘤組織蠟塊，并收集30例胃癌患者的腫瘤組織蠟塊，通過免疫組化法觀察淋巴管密度及微血管密度(MVD)，并觀察淋巴生成及血管誘導(dǎo)相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C)、果蠅同源異形盒蛋白1(PROX-1)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、的表達(dá)。結(jié)果GIST的淋巴管及MVD計(jì)數(shù)均顯著低于胃癌組織(P<0.05)；胃間質(zhì)瘤、小腸間質(zhì)瘤及胃癌組織中VEGF-C、PROX-1、HIF-1α表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；HIF-1α低表達(dá)組的MVD明顯低于高表達(dá)組(P<0.05)。結(jié)論 間質(zhì)來源GIST的淋巴管及微血管計(jì)數(shù)明顯少于上皮來源的胃癌，VEGF-C、HIF-1α表達(dá)可能與GIST微血管生成相關(guān);VEGF-C可能與GIST淋巴管生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：胃腸道間質(zhì)瘤；淋巴管；微血管

胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)起源于胃腸道間葉組織，占胃腸道惡性腫瘤的1%～3%，多發(fā)病于中老年患者[1，2]。GITST患者20%～30%屬于惡性，且11%～47%首次就診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[3，4]。GIST常見轉(zhuǎn)移方式為血行轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移僅占小部分，且手術(shù)不推薦行淋巴結(jié)清掃，因此對于GIST的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制研究至關(guān)重要[5]。淋巴管是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通道，其生成受多種因素控制，但淋巴管特異分子標(biāo)志物有限[6]。胃癌的主要轉(zhuǎn)移途徑為淋巴轉(zhuǎn)移，盡管與GIST組織來源不同，但通過對相同發(fā)病部位的胃癌進(jìn)行對比研究有重要價(jià)值[7，8]。淋巴生成及血管誘導(dǎo)相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-C)、果蠅同源異形盒蛋白1(PROX-1)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)在GIST中淋巴管及血管的生成中發(fā)揮作用，但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。2010年1月～2014年12月,我們對GIST的淋巴管及血管生成機(jī)制進(jìn)行了研究?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料GIST患者70例，經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)及免疫組織學(xué)確診，制備石蠟包塊，其中胃間質(zhì)瘤患者38例，小腸間質(zhì)瘤患者32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織學(xué)符合GIST診斷；②免疫組織化學(xué)檢查CD117為陽性；③原發(fā)性GIST患者，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腹膜種植，術(shù)前未接受甲磺酸伊馬替尼輔助化療。70例患者中男42例、女28例，年齡(58.52±9.06)歲，患者均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另選取同期我院胃癌患者術(shù)后組織30例份，經(jīng)術(shù)后病理確診，制備石蠟包塊，腫瘤組織均為上皮來源，排除間質(zhì)瘤、肉瘤等非上皮源性腫瘤。30例胃癌患者中男21例、女9例，年齡(53.28±8.22)歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。

1.2淋巴管及微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)采用免疫組化法。將選取的石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，多聚賴氨酸浸泡后37 ℃烤箱烘干備用。脫蠟水化后1 mmol/L/pH8.0檸檬酸溶液中抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷，依次滴加一抗、二抗，PBS緩沖液漂洗，切片染色觀察。PBS取代一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照，保證顯色反應(yīng)的單一性及可比性。參照相關(guān)文獻(xiàn)，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富病理科醫(yī)師雙盲閱片，MVD計(jì)數(shù)依據(jù)CD31染色結(jié)果，于毛細(xì)血管最多處評(píng)估MVD，先用低倍鏡尋找微血管密集區(qū)域，然后用高倍鏡觀察計(jì)數(shù)，觀察3個(gè)視野，微血管顯色為單個(gè)或一簇棕色內(nèi)皮細(xì)胞，大血管、纖維化、炎癥壞死的微血管不計(jì)數(shù)；淋巴管計(jì)數(shù)依據(jù)D2-40染色結(jié)果，為裂縫樣或多開口薄壁管腔，計(jì)數(shù)方法同微血管計(jì)數(shù)[9]。

1.3淋巴生成及血管誘導(dǎo)相關(guān)因子VEGF-C、PROX-1、HIF-1α蛋白表達(dá)檢測將各組織通過石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，備用。通過免疫組化超敏法，使用二甲苯脫蠟并水化，雙氧水浸泡10 min清除過氧化物酶活性并沖洗，使用EDTA液進(jìn)行抗原修復(fù)，一次添加一抗、二抗，沖洗后37 ℃恒溫孵育，DAB染色，鏡下觀察。相關(guān)抗體檢測采用分級(jí)判定，無陽性細(xì)胞及陽性細(xì)胞<5%為-，陽性細(xì)胞數(shù)5%～20%為+，陽性細(xì)胞數(shù)20%～50%為++，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為+++。-、+、++定為低表達(dá)，+++定為高表達(dá)。

2結(jié)果

2.1淋巴管及MVD計(jì)數(shù)D2-40染色陽性的淋巴管形狀不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜呈棕褐色，在GIST及胃癌組織中均可看到D2-40陽性細(xì)胞，在血管及平滑肌細(xì)胞中未見D2-40陽性細(xì)胞；CD31染色陽性多分布在腫瘤組織內(nèi)部及邊緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞質(zhì)及胞膜呈棕褐色。

GIST組織內(nèi)少有瘤內(nèi)淋巴管，胃癌組織瘤內(nèi)淋巴管難以界定，不予計(jì)數(shù)。胃間質(zhì)瘤及小腸間質(zhì)瘤瘤內(nèi)淋巴管計(jì)數(shù)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.425，P=0.336)；胃間質(zhì)瘤與小腸內(nèi)間質(zhì)瘤瘤旁淋巴管計(jì)數(shù)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=1.132，P=0.131)，兩者分別與胃癌組織比較，瘤旁淋巴計(jì)數(shù)明顯低于胃癌組織(P<0.05)；胃間質(zhì)瘤與小腸內(nèi)間質(zhì)瘤MVD計(jì)數(shù)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.036，P=0.486)，兩者分別與胃癌組織比較，MVD計(jì)數(shù)明顯低于胃癌組織(P<0.05)。

表1　　　　GIST和胃癌患者淋巴管及MVD計(jì)數(shù)

注：與胃間質(zhì)瘤比較，△P<0.05；與小腸間質(zhì)瘤比較，○P<0.05。

2.2相關(guān)抗體VEGF-C、PROX-1及HIF-1α蛋白在GIST及胃癌組織中表達(dá)見表2。胃間質(zhì)瘤、小腸間質(zhì)瘤及胃癌組織中各相關(guān)抗體表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

2.3GIST患者淋巴管及MVD計(jì)數(shù)與相關(guān)抗體表達(dá)的關(guān)系GIST患者組織中VEGF-C與淋巴管密度及MVD計(jì)數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)，HIF-1α與MVD計(jì)數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)。見表3。

3討論

GIST來源于間質(zhì)，僅有一半能被放射學(xué)或內(nèi)鏡檢查所發(fā)現(xiàn)，無痛及生長緩慢是其主要特點(diǎn)，但臨床中70%的患者可出現(xiàn)臨床癥狀。淋巴管是腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的主要通道，淋巴管由靜脈發(fā)育生成，受PROX-1調(diào)節(jié)，淋巴系統(tǒng)出現(xiàn)，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化為淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF-C主要表達(dá)于心臟、小腸、卵巢等，在淋巴管豐富的腸系膜中高表達(dá)，其可與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞受體VEGFR-3結(jié)合，刺激淋巴管生長[10，11]。淋巴管密度主要通過檢測D2-40表達(dá)體現(xiàn)，D2-40是抗podoplanin抗體，可反映淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的唾液糖蛋白抗原決定簇，被認(rèn)為是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)志物[12]。

表2　　　　淋巴生成及血管誘導(dǎo)相關(guān)因子在GIST

表3　　　　GIST患者淋巴管及MVD計(jì)數(shù)與相關(guān)抗體

本研究發(fā)現(xiàn)淋巴管染色特異性較高，血管及平滑肌細(xì)胞中未見D2-40陽性細(xì)胞表達(dá)；胃間質(zhì)瘤與小腸間質(zhì)瘤的瘤內(nèi)淋巴管及瘤旁淋巴管計(jì)數(shù)均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胃癌組織由于瘤內(nèi)淋巴管無法界定未進(jìn)行計(jì)數(shù)，在瘤旁淋巴管比較中，GIST淋巴管計(jì)數(shù)明顯低于胃癌組織，可能是由于胃癌更易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的原因。在胃間質(zhì)瘤、小腸間質(zhì)瘤及胃癌組織中，相關(guān)抗體VEGF-C及PROX-1的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩種抗體表達(dá)在兩類腫瘤中無差別。

CD31廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞上，是內(nèi)皮依賴性微血管存在標(biāo)志物[13]，可反映MVD。HIF-1α是確定HIF活性的標(biāo)志，在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)，調(diào)節(jié)血管生成及腫瘤發(fā)展，腫瘤的過度生長常伴隨缺血缺氧，缺氧則可激活HIF表達(dá)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)GIST的MVD計(jì)數(shù)明顯低于胃癌組織，這可能與胃癌發(fā)生部位特點(diǎn)及GIST生長較緩慢相關(guān)。兩種間質(zhì)瘤及胃癌組織間HIF-1α表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，兩類腫瘤微血管生成對于HIF-1α依賴性并不存在差異。HIF-1α表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)顯著相關(guān)，說明GIST組織內(nèi)微血管的生成與HIF-1α的表達(dá)相關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，GIST與胃癌由于組織來源不同，淋巴管及MVD的分布存在差異，VEGF-C、HIF-1α表達(dá)可能與GIST微血管生成相關(guān)，GIST淋巴管生成機(jī)制可能與VEGF-C有關(guān)。

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(收稿日期:2015-11-06)

中圖分類號(hào)：R735

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0040-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.015

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究項(xiàng)目(J201102)。