王彥平　王懷中　姜運(yùn)良

摘要：通過(guò)文獻(xiàn)搜索，收集整理了影響豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的顯著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點(diǎn)，基于飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大約克（n=400）和長(zhǎng)白（n=399）樣本進(jìn)行SNP快速分型，并分析了這些位點(diǎn)在大約克和長(zhǎng)白群體內(nèi)的基因型、等位基因頻率、哈代-溫伯格平衡狀態(tài)等遺傳學(xué)特征。結(jié)果表明：利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可對(duì)17個(gè)影響豬肉質(zhì)和生長(zhǎng)性狀的顯著SNP位點(diǎn)進(jìn)行同時(shí)快速基因分型，平均個(gè)體檢出率為96.35%；17個(gè)被檢SNP位點(diǎn)中9個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)，其它8個(gè)為只有一種基因型的單態(tài)位點(diǎn)；多態(tài)SNP位點(diǎn)中有6個(gè)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其它3個(gè)嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡。本研究收集了對(duì)豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的SNP位點(diǎn)，探討了利用飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多位點(diǎn)SNP快速分型的可行性，為今后建立豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；單核苷酸多態(tài)性（SNP）；等位基因頻率；標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號(hào)：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）08-0128-06

AbstractIn the study， we collected the single nucleotide polymorphism （SNP） loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS） technique， we genotyped the samples of Yorkshire （n=400） and Landrace （n=399）， and analyzed the genotype frequency， allele frequency， and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS， we successfully genotyped 17 SNPs at the same time， and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci， and the other 8 were monomorphic loci， which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally， for the 9 polymorphic SNPs， 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality， and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS， which provided foundations for the marker assisted selection （MAS） and the improvement of genetic progress of pigs.

KeywordsPig； Time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Allele frequency； Marker assisted selection （MAS）

近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記逐漸用于畜禽的標(biāo)記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）育種中，以提高遺傳選育的準(zhǔn)確性。但是，對(duì)于數(shù)量性狀，應(yīng)用單個(gè)或者少數(shù)基因的MAS只能夠解釋很小比例的遺傳變異，因此限制了標(biāo)記輔助選擇在畜禽育種中的應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于高密度SNP芯片的基因組選擇技術(shù)克服了傳統(tǒng)MAS的缺陷，但是其成本相對(duì)較高，對(duì)奶牛育種來(lái)說(shuō)是可以承受的，對(duì)豬、雞和羊等畜禽來(lái)說(shuō)太高，在一定程度上影響了基因組選擇在豬、雞和羊等畜禽中的應(yīng)用。

Zhang等[1]通過(guò)模擬研究表明，使用高密度芯片總標(biāo)記數(shù)5%的標(biāo)記即可獲得高密度芯片95%的準(zhǔn)確性，而且使用性狀篩選標(biāo)記效果要好于均勻分布的標(biāo)記。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，廣大科研工作者對(duì)影響豬繁殖、肉質(zhì)和抗病等常規(guī)選育受到限制的性狀基因進(jìn)行了廣泛的研究。通過(guò)候選基因、數(shù)量性狀基因座（QTL）定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析等策略已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)影響豬繁殖、肉質(zhì)和抗病等性狀的主效基因、QTL和DNA標(biāo)記。本研究通過(guò)文獻(xiàn)搜索，收集整理了對(duì)豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）位點(diǎn)，探討利用飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多位點(diǎn)SNP快速分型的可行性，為今后建立豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物和樣本采集

研究所測(cè)樣品均來(lái)自山東省菏澤宏興原種豬繁育有限公司，包括大約克（Yorkshire， n=400）和長(zhǎng)白（Landrace， n=399）共799頭仔豬。仔豬達(dá)35日齡時(shí)，每窩隨機(jī)選取3～5頭生長(zhǎng)發(fā)育良好的健康仔豬，取耳組織，加入70%乙醇，-20℃保存?zhèn)溆谩７?氯仿法提取基因組DNA。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度分析， -20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2具有顯著效應(yīng)的豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀SNP搜集

通過(guò)PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、中國(guó)知網(wǎng)（http：//www.cnki.net/）和dpSNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html）等公共生物信息數(shù)據(jù)資源進(jìn)行文獻(xiàn)搜索和SNP信息收集，并通過(guò)不同來(lái)源信息的重復(fù)驗(yàn)證和篩選，獲得對(duì)豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀具有顯著效應(yīng)的SNP標(biāo)記。

1.3SNP分型檢測(cè)

基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型平臺(tái)進(jìn)行SNP分型檢測(cè)。Sequenom MassArray SNP檢測(cè)具體原理是先根據(jù)位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)特異性PCR引物和延伸引物（具體引物信息如表2所示），將包含SNP位點(diǎn)區(qū)域的DNA模板通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以SAP酶去除多余dNTPs，然后對(duì)待檢位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行單堿基延伸，位點(diǎn)特異性延伸引物在突變位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基并終止，因此其可根據(jù)突變類型的差異而連接上不同的ddNTPs，形成分子量差異。延伸產(chǎn)物經(jīng)過(guò)樹(shù)脂純化后，點(diǎn)樣至靶片上，使用質(zhì)譜儀對(duì)不同延伸產(chǎn)物的分子量進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)專用的分析軟件MassArray Typer 4.0 進(jìn)行處理，就可得到各突變位點(diǎn)的具體基因型。

1.4數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 整理原始數(shù)據(jù)。利用皮爾遜卡方統(tǒng)計(jì)量對(duì)各SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)，并利用Excel中的CHIDIST函數(shù)計(jì)算卡方值相應(yīng)的P值。

皮爾遜卡方統(tǒng)計(jì)量定義為χ2=∑（O-E）2E，該式是對(duì)某一給定位點(diǎn)所有基因型的求和。式中O（Observed）代表每個(gè)基因型的觀測(cè)數(shù)目，E（Expected）代表每個(gè)基因型在哈代-溫伯格平衡定律成立的假定下的期望數(shù)目。

2結(jié)果與分析

2.1樣本基因組DNA提取及檢測(cè)

使用經(jīng)典的酚-氯仿法提取豬耳組織樣本中的基因組DNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠圖顯示DNA條帶單一、清晰、無(wú)雜質(zhì)，沒(méi)有彌散、拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明DNA完整度好。通過(guò)Nanodrop紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA的純度和濃度，調(diào)整DNA終濃度在100 ng/μL左右，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2影響豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的顯著SNP搜集

通過(guò)對(duì)公共生物信息數(shù)據(jù)資源進(jìn)行文獻(xiàn)搜索，本研究共收集整理了24個(gè)SNP位點(diǎn)，其中14個(gè)SNP來(lái)自10個(gè)候選基因，包括氟烷基因（Hal，1個(gè)SNP）、酸肉基因（RN，2個(gè)SNP）、脂肪細(xì)胞決定和分化因子1基因（ADD1，1個(gè)SNP）、乙酰輔酶A羧化酶α基因（ACACA，1個(gè)SNP）、肌肉生長(zhǎng)抑制素基因（MSTN，3個(gè)SNP）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2基因（IGF2，1個(gè)SNP）、黑素皮質(zhì)素受體4基因（MC4R，1個(gè)SNP）、Leptin受體基因（LEPR，1個(gè) SNP）、肌細(xì)胞生成素Myogenin 基因（MyoG，1個(gè) SNP）、脂肪肥胖相關(guān)基因（FTO，2個(gè)SNP）；10個(gè)SNP來(lái)自3篇肉質(zhì)相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析文章。24個(gè)SNP位點(diǎn)的具體信息詳見(jiàn)表1所示。

根據(jù)位點(diǎn)信息設(shè)計(jì)特異性PCR引物和延伸引物時(shí)，有4個(gè)SNP位點(diǎn)與其它位點(diǎn)的引物發(fā)生沖突，包括RN的1個(gè) SNP、MSTN的1個(gè) SNP、IGF2的1個(gè) SNP和 G5位點(diǎn)，沒(méi)有包含在檢測(cè)范圍內(nèi)。20個(gè)SNP位點(diǎn)在基因分型中所使用的引物信息詳見(jiàn)表2所示。

2.3大約克和長(zhǎng)白群體SNP分型結(jié)果

對(duì)本研究中大約克（n=400）和長(zhǎng)白（n=399）共799個(gè)樣本基因組DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型平臺(tái)進(jìn)行SNP基因分型，20個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)中有3個(gè)分型失?。℅3、LEPR和MSTN3），其余17個(gè)SNP位點(diǎn)均能夠很好地檢測(cè)出常見(jiàn)的三種基因型。17個(gè)SNP位點(diǎn)的平均個(gè)體檢出率為96.35%，其中最高檢出率為99.01%，最低檢出率為 89.51%，各SNP位點(diǎn)具體檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表3所示。

17個(gè)成功檢測(cè)的SNP位點(diǎn)中有8個(gè)（Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2）為單態(tài)位點(diǎn)，即這些SNP位點(diǎn)在被檢的大約克和長(zhǎng)白樣品中只有一種基因型，其余9個(gè)SNP位點(diǎn)（ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8）在兩個(gè)品種內(nèi)均存在多態(tài)。利用皮爾遜卡方統(tǒng)計(jì)量對(duì)9個(gè)具有多態(tài)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)，結(jié)果表明6個(gè)SNP位點(diǎn)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，其它3個(gè)SNP位點(diǎn)（G1、G2和G4）嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡。

3討論與結(jié)論

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組上廣泛分布并能穩(wěn)定遺傳的DNA序列多態(tài)性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生了一系列能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模高通量的基因分型方法，如高通量測(cè)序技術(shù)、芯片技術(shù)和飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)等。飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在SNP分型中表現(xiàn)出的高通量、準(zhǔn)確性高、靈敏度高三大特點(diǎn)，及其較高的性價(jià)比，已成為眾多科研人員進(jìn)行SNP基因分型研究的首選[15，16]。本研究利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了大約克和長(zhǎng)白群體799個(gè)樣本的17個(gè)SNP位點(diǎn)，其檢出率平均達(dá)96.35%，說(shuō)明飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)和樣本的高通量和自動(dòng)化SNP分型。但應(yīng)該指出的是，飛行時(shí)間質(zhì)譜法是利用多重PCR反應(yīng)的原理實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)，過(guò)多的引物在一個(gè)反應(yīng)體系中容易形成引物二聚體，增加引物設(shè)計(jì)的難度。飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的這種局限性，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致某些選定的SNP位點(diǎn)不能包括在同一個(gè)反應(yīng)體系中。例如本研究中，預(yù)篩選時(shí)選擇了24個(gè)SNP位點(diǎn)，但在設(shè)計(jì)特異性PCR引物和延伸引物時(shí)，4個(gè)位點(diǎn)（包括RN的1個(gè)SNP、MSTN的1個(gè)SNP、IGF2的1個(gè)SNP和G5位點(diǎn)）與其它位點(diǎn)的引物發(fā)生沖突，不能包含在檢測(cè)范圍內(nèi)。

在通過(guò)文獻(xiàn)和公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行顯著效應(yīng)SNP信息收集過(guò)程中，有些候選基因，如心臟脂肪酸結(jié)合蛋白基因[17]、鈣蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二?；视王；D(zhuǎn)移酶基因[19]等，利用的是基于PCR-RFLP方法進(jìn)行的SNP基因分型，文獻(xiàn)中沒(méi)有具體的序列信息，不好確定SNP在基因組中的具體位置。我們?cè)?jīng)嘗試用文獻(xiàn)中提供的引物進(jìn)行PCR測(cè)序，但結(jié)果不理想。另外，有些基因報(bào)道較多，但是不同研究者報(bào)道的基因效應(yīng)不一致，故有幾個(gè)常見(jiàn)豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)相關(guān)基因排除在本研究之外。本研究中還有部分SNP來(lái)自于全基因組關(guān)聯(lián)分析文章。全基因組關(guān)聯(lián)分析是近幾年發(fā)展起來(lái)的鑒定影響目標(biāo)性狀顯著SNP的一種方法。但是目前，肉質(zhì)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析文章不多，而且有些文章[20，21]只給出了某個(gè)SNP位點(diǎn)的P值，沒(méi)有指明SNP兩個(gè)等位基因的效應(yīng)，這樣的文章對(duì)我們?cè)赟NP收集中參考意義也不大。

本研究中，17個(gè)成功檢測(cè)的SNP位點(diǎn)中有8個(gè)為單態(tài)位點(diǎn)，這8個(gè)SNP位點(diǎn)均具有較大的效應(yīng)。大約克和長(zhǎng)白均是高度選育的商業(yè)化豬種，在長(zhǎng)期的選擇過(guò)程中，使這些發(fā)現(xiàn)較早且效應(yīng)較大的SNP位點(diǎn)逐漸純合。最顯著的例子是氟烷基因（Hal）[2]，氟烷基因能夠促進(jìn)豬的肌肉生長(zhǎng)，但是容易引起豬應(yīng)激綜合征。自從20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)氟烷基因編碼蛋白的一個(gè)氨基酸突變（由精氨酸變成半膚氨酸）是導(dǎo)致豬應(yīng)激綜合征的原因以來(lái)，各育種公司利用MAS方法從群體中逐漸剔除了Hal的有害等位基因。另外9個(gè)多態(tài)SNP位點(diǎn)中，有3個(gè)SNP位點(diǎn)（G1、G2和G4）嚴(yán)重偏離哈代-溫伯格平衡，說(shuō)明這3個(gè)位點(diǎn)已經(jīng)受到了高度選擇。對(duì)于其它6個(gè)處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)的多態(tài)SNP位點(diǎn)，我們認(rèn)為可能有兩種原因，一是這些SNP是影響豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)形狀的顯著SNP，但是效應(yīng)較小；二是這些SNP具有多效性，使其在選育中受到的選育程度較輕。

總之，本研究利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)成功檢測(cè)了影響豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀的17個(gè)SNP位點(diǎn)，建立了一套高通量、快速、準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)平臺(tái)，為今后建立豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀遺傳標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和利用、加快豬的遺傳研究進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。

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