GSDMB/ORMDL3基因CpG序列多態(tài)性與中國漢族人哮喘相關的臨床研究

袁亞平++吳浩++楊華++顧文超

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.16.101

[摘要] 目的 分析漢族人GSDMB/ORMDL3基因CpG序列[胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）]單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）與支氣管哮喘的相關性。 方法 運用SNaPshot技術檢測哮喘患者（2014年1月—2016年1月在上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院呼吸科就診的支氣管哮喘患者（n=170例）和健康人（n=172例）GSDMB/OMDL3基因CpG序列的3個SNP位點，rs7216389、rs4065275和rs12603332，比較組間基因型和等位基因頻率的差異。結果 GSDMB基因rs7216389存在C-T多態(tài)性，ORMDL3基因rs4065275存在A-G多態(tài)性，ORMDL3基因rs12603332存在T-C多態(tài)性。Rs7216389 TT TC CC基因型在哮喘組頻率分別為59.4%、36.5%、4.1%，對照組45.9%、41.9%、12.2%，T C等位基因在哮喘組頻率分別為77.6%、22.4%，對照組66.9%、33.1%。Rs4065275 GG GA AA基因型在哮喘組頻率分別為57.1%、32.4%、10.6%，對照組41.9%、38.4%、19.8%，G A等位基因在哮喘組頻率分別為73.2%、26.8%，對照組61.0%、9.0%。Rs12603332 CC CT TT基因型在哮喘組頻率分別為61.2%、34.1%、4.7%，對照組50.6%、38.4%、11.0%，C T等位基因在哮喘組頻率分別為78.2%、21.8%，對照組69.8%、30.2%。這3個SNP位點基因型和等位基因頻率在哮喘組和對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 Rs7216389C-T，rs4065275A-G， rs12603332T-C位點變異與中國漢族人哮喘明顯相關。

[關鍵詞] GSDMB/OMDL3；單核苷酸多態(tài)性；支氣管哮喘

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）06（a）-0101-04

Risk of Asthma is Associated with CpG-site Polymorphisms at the GSDMB/ORMDL3 Among Han Population in China

YUAN Ya-ping， WU Hao，YANG Hua，GU Wen-chao

Department of Respiratory Medicine，People's Hospital of Shanghai Pudong District， Shanghai，201200China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between CpG-site polymorphisms at the GSDMB/ORMDL3 with allergic asthma in a population of Hans in China. Methods A tota of 170 asthmapatients were recruitedfrom January 2014 to January 2016 in People's Hospital of Shanghai Pudong Districtand 172 healthy controls recruited from Hans population in china were genotyped to detect CpG-site single nucleotide polymorphism（SNP） of GSDMB/ORMDL 3 genes（rs7216389，rs4065275 and rs12603332） using SNaPshot technology. Results There was SNPs in GSDMB gene rs7216389 C-T， ORMDL3 geners4065275 A-Gand rs12603332T-C.Rs7216389 TT TC CC genotype frequency in asthma were 59.4%，36.5%，4.1%.in control were 45.9%，41.9%，12.2%.T C allele frequency in asthma were 77.6%，22.4%.in control were 66.9%，33.1%.Rs4065275 GG GA AA genotype frequency in asthma were57.1%，32.4%，10.6%.in control were41.9%，38.4%，19.8%.G A allele frequency in asthma were 73.2%，26.8%.in control were 61.0%，39.0%.Rs12603332 CC CT TT genotype frequency in asthma were61.2%，34.1%，4.7%.in control were50.6%，38.4%，11.0%.C T allele frequency in asthma were78.2%，21.8%.in control were69.8%，30.2%.Genotype frequency and allele frequency of the three SNPs were significantly different （P<0.05） in asthma group compared with control group. Conclusion Our results show that rs7216389C-T，rs4794820 A-G and 12603332T-C variations are associated with higher asthma risk among Han population in China.endprint

[Key words] GSDMB/ORMDL3； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Asthma

支氣管哮喘是一種有家族聚集傾向的多基因遺傳病，采用病例對照設計的全基因組關聯(lián)研究（GWAS）[1，2]，發(fā)現(xiàn)哮喘相關的基因位于染色體17q21，包含GSDMB基因（gasdermin家族成員之一）和ORMDL3基因（ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3）。Rs7216389 （C/T），rs4065275 （A/G） 和 rs12603332 （T/C）是位于GSDMB/ORMDL3基因CpG序列（胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）的縮寫）的單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphism SNP）已經證實與哮喘相關[3]，Rs7216389位于GSDMB基因，rs4065275 和 rs12603332位于ORMDL3基因。該研究選擇2014年1月—2016年1月在上海市浦東新區(qū)人民確診的哮喘患者170例，分析這3個SNP與漢族人群哮喘的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

哮喘組：選自2014年1月—2016年1月在上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院就診的支氣管哮喘患者，共170例，年齡18～70歲，平均年齡37歲；其中男性87例，女性83例，支氣管哮喘診斷符合《支氣管哮喘防治指南》[4]。對照組：上海地區(qū)172名健康體檢者，年齡28～70歲，平均年齡41歲，其中男性89名，女性83名，無哮喘和過敏性疾病史及相關家族史，肺通氣功能正常。所有患者與對照組年齡相匹配，均為無親緣關系的漢族人，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2實驗方法

血標本采集與DNA制備采集靜脈血2 mL用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，分離血漿。剩余血細胞抽取白細胞基因組DNA（采用基因組DNA提取試劑盒 promega），按說明書操作。DNA溶于50uLTE緩沖液，稀釋為100 ng/uL，-20℃保存。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）從基因組數(shù)據庫網站獲取rs7216389、rs4065275和rs12603332位點的序列，設計引物，引物序列見表1， 引物由上海生工生物工程公司合成，稀釋為20 pmol/μL使用。PCR反應體系共15 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×Taq MasterMix7.5 μL，0.5 μmol/L， 用滅菌雙蒸水補充至15 μL。擴增循環(huán)參數(shù)： 94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸30s，共35個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳，片段條帶大小正確后，PCR擴增產物純化好置-20℃冰箱凍存用于基因分型。

基因分型應用單堿基延伸（SNaPshot）法進行基因分析。取純化后的PCR產物1 μL，分別取rs7216389、rs4065275和rs12603332位點的序列引物各0.2 μL，SNPshot@RMultiplex試劑1 μL，用滅菌雙蒸水補足至5 μL。PCR循環(huán)條件：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共進行25個循環(huán)。ABI3730 DNA Analyzer（48）型遺傳分析儀上機檢測基因型。用Gene mapper 5.0（ABI）軟件讀取結果。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據統(tǒng)計分析，χ2檢驗比較組間基因型及等位基因頻率?；蛐秃偷任换虻碾x散程度采用哈迪溫伯格平衡分析（ Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）確定相對危險度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

Rs7216389， rs4065275，rs12603332的基因型和等位基因頻率見表2。rs7216389-TT，rs4065275-GG，rs12603332-CC在哮喘組明顯增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘患者等位基因rs7216389-T，rs4065275-G，rs12603332-C與對照組比較，明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。哮喘組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P>0.05）。

3 討論

該研究通過對170例哮喘-172例對照研究，顯示GSDMB/ORMDL3基因CpG序列rs7216389，rs4065275和rs12603332位點變異與漢族人哮喘相關。本研究中，哮喘患者rs7216389TT基因型頻率59.4%，較健康人45.9%明顯增高，T等位基因頻率在哮喘組77.6%，較健康人66.9%明顯增高，胡慧婷等[5]研究顯示中國南方漢族人哮喘患者rs7216389 TT頻率67.4%，T頻率82.0%，均較健康人明顯增高，與本研究接近，且發(fā)現(xiàn)吸煙患者rs7216389TT明顯高于非吸煙組。Zihlif M[6]等研究亦顯示哮喘兒童rs7216389SNP位點T明顯增高。GSDMB基因是gasdermin家族成員之一，在促進或維持上皮細胞的終末分化狀態(tài)中具有重要作用[7]。ORMDL3基因編碼位于內質網上的血清類粘蛋白1樣蛋白3，可以通過抑制鈣泵的活性導致內質網鈣平衡失調，進而引發(fā)內質網應激，從而導致未折疊蛋白反應進而成為炎癥發(fā)生的內源性誘因。哮喘患者中，rs7216389與外周血淋巴細胞ORMDL3 mRNA水平相關，提示其不僅調控GSDMB，而且調控ORDML3基因的表達[1]。Rs4065275GG基因型頻率在哮喘組57.1%，較對照組41.9%明顯增高，G在哮喘組73.2%，較對照組61.0%明顯增高。一項多中心研究顯示[8]，rs4065275G等位基因在哮喘患兒明顯增高，且體外研究顯示，rs4065275位點A突變?yōu)镚導致單核細胞白介素4和白介素13釋放增加，這可能是rs4065275變異影響哮喘的機制之一。Rs12603332CC基因頻率在本研究中哮喘組61.2%，較對照組50.6%明顯增高，C在哮喘組78.2%，較對照組69.8%明顯增高，王冰潔等[9]研究哮喘患兒rs12603332CC基因型頻率57.0%，C等位基因頻率75.0%，且發(fā)現(xiàn)哮喘患兒CC基因型血清Lyso-PC和apoB水平明顯增高，提示血清中Lyso-PC和apoB水平可能與哮喘易感基因ORMDL3 rs12603332位點共同作用導致兒童哮喘的發(fā)生。endprint

CpG是胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鳥嘌呤（G）的縮寫，基因組中長度300-3000bp的富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域，稱為CpG島，主要存在于基因的5區(qū)域，啟動子區(qū)中CpG島的未甲基化狀態(tài)是基因轉錄所必需的，CpG序列中C的甲基化可導致轉錄被抑制。CpG位點的單個核苷酸多態(tài)性與CpG的甲基化相關[10]，CpG序列甲基化影響mRNA轉錄。研究顯示[3]，rs72l6389-T位于GSDMB基因第一個內含子的CpG序列，突變減少了一個CpG，該位點的DNA序列是非甲基化的，但和ORMDL3基因的5-甲基胞嘧啶CpG島的甲基化相關。Rs4065275-G在ORMDL3基因的5-甲基胞嘧啶的CpG區(qū)，突變產生了一個CpG，該位點DNA甲基化的頻率明顯增高達52.9%，且周圍CpG區(qū)的甲基化亦明顯增高，而rs4065275-AA的序列是非甲基化。rs12603332-C位于ORMDL3基因CpG島的附近，突變生成了一個CpG，該位點的DNA序列僅有2.88%甲基化，rs12603332-TT均非甲基化，但其周圍的CpG序列甲基化頻率增高，具體原理尚不明確。該研究顯示攜帶rs7216389-TT （GSDMB）， rs4065275-GG and rs12603332-CC（ORMDL3） 的兒童，外周血淋巴細胞中GSDMB和ORMDL3基因的mRNA明顯增高，同時還顯示DNA甲基化和ORMDL3基因mRNA水平相關，因此假設這三個CpG序列的單核苷酸多態(tài)性，導致DNA序列的甲基化，從而增加GSDMB和ORMDL3基因的mRNA轉錄。

該研究顯示在哮喘患者中，rs7216389-TT，rs4065275-GG，rs12603332-CC明顯增高，既往研究提示可能和CpG序列的甲基化有關，但具體機制尚不明確，期待進一步研究。

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（收稿日期：2017-03-08）endprint