嫩化時間對大口黑鱸半成品品質(zhì)的影響

鉏曉艷 鄒開封 葉麗秀 王俊 王偉瓊 熊光權(quán)

摘 要：為改善淡水魚加工和滅菌過程導(dǎo)致的肉質(zhì)老化和嫩度下降問題，以大口黑鱸（鱸魚）為研究對象，通過物性測定、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和掃描電鏡系統(tǒng)考察復(fù)合嫩化劑（氯化鈣1.2‰ 、復(fù)合磷酸鹽1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）作用時間對鱸魚半成品的嫩化效果。結(jié)果表明：用該嫩化劑嫩化鱸魚半成品1.0～1.5 h，可顯著降低魚肉剪切力和硬度分別至（21.89±0.27） N和（111.98±3.46） g，提高魚肉pH值和L*，并增加魚肉肌原纖維小片化指數(shù)；上述指標(biāo)均和對照組差異顯著（P<0.05）。凝膠電泳結(jié)果顯示，嫩化后魚肉肌原纖維中分子質(zhì)量38 kD的蛋白和原肌球蛋白發(fā)生降解，在約37 kD和28 kD處產(chǎn)生了新的蛋白條帶。掃描電鏡結(jié)果表明，嫩化后魚肉組織變得蓬松、肌纖維間連接物消失、肌原纖維發(fā)生斷裂。該復(fù)合嫩化劑效果良好，嫩化1.0～1.5 h可顯著提升魚肉半成品品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：大口黑鱸；嫩化；質(zhì)構(gòu)特性；蛋白質(zhì)電泳；掃描電鏡

Effect of Tenderization Time on the Quality of Semi-Finished Products from Micropterus salmoides

ZU Xiaoyan1， ZOU Kaifeng2， YE Lixiu1， WANG Jun1， WANG Weiqiong1， XIONG Guangquan1，*

（1. Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology， Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China；

2. Qianjiang Longwan Aquatic Technology Service Center， Qianjiang 433139， China）

Abstract： To overcome the quality deterioration and tenderness decline of fresh water fish during processing and sterilization， the tenderization effect of a meat tenderizer consisting of 1.2‰ calcium chloride， 1.2‰ phosphate and

1.8‰ papain on semi-finished products from the largemouth bass Micropterus salmoides as a function of treatment time was evaluated by texture analysis， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） and scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that after 1.0–1.5 h of tenderization， the shearing force and hardness of fish meat were significantly reduced to （21.89 ± 0.27） N and （111.98 ± 3.46） g， respectively with a simultaneous significant increase in pH， brightness （L*） and myofibril fragmentation index （P < 0.05）. SDS-PAGE showed that the myofibrillar protein with a molecular weight of 38 kD and tropomyosin were degraded， consequently forming new protein bands with molecular weight of about 37 and 28 kD. Under SEM， fluffy microstructures with disappeared connective tissues and broken myofibers were observed for tenderized bass meat. The tenderizer could significantly improve the quality of bass semi-finished products at tenderization time of 1.0–1.5 h.

Key words： Micropterus salmoides； tenderization； texture properties； protein electrophoresis； scanning electron microscopy

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001

中圖分類號：TS254.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2016）07-0001-05

引文格式：

鉏曉艷， 鄒開封， 葉麗秀， 等. 嫩化時間對大口黑鱸半成品品質(zhì)的影響[J]. 肉類研究， 2016， 30（7）： 1-5. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

ZU Xiaoyan， ZOU Kaifeng， YE Lixiu， et al. Effect of tenderization time on the quality of semi-finished products from Micropterus salmoides[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名鱸魚，隸屬鱸形目黑鱸屬，肉味鮮美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高，是名貴魚類之一，也是淡水養(yǎng)殖的主要品種[1]。目前，鱸魚調(diào)理品加工業(yè)發(fā)展迅速，但加工和滅菌過程會導(dǎo)致其肉質(zhì)嫩度降低，口感下降，這在一定程度上限制了鱸魚調(diào)理品的銷售及加工業(yè)的發(fā)展。

受傳統(tǒng)消費方式和觀念的影響，淡水魚加工中嫩化研究很少，相關(guān)研究集中在實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的牛肉[2-4]、豬肉[5]和魷魚[6]制品上。目前使用的嫩化方法中磷酸鹽、鈣離子和蛋白酶受到較多關(guān)注[7-8]，但三者協(xié)同作用的嫩化效果研究，尤其對淡水魚加工品肉質(zhì)改善效果及其最適作用時間的研究尚未見報道。

嫩化劑使用時間對魚肉加工品品質(zhì)的影響至關(guān)重要，實驗前期研究顯示，復(fù)合嫩化劑（氯化鈣1.2‰、復(fù)合磷酸鹽1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）對魚肉嫩化效果明顯[9]，但嫩化時間難以控制，時間過短肉品嫩度不夠，時間過長肉品糜化口感下降。目前，多數(shù)研究將表征肉品嫩度的剪切力作為單一指標(biāo)[5，7-8，10]進(jìn)行嫩化劑和嫩化時間的篩選，出現(xiàn)理論結(jié)果與實際應(yīng)用難以銜接的現(xiàn)象。因此，本實驗以鱸魚半成品為研究對象，系統(tǒng)研究復(fù)合嫩化劑（氯化鈣1.2‰、復(fù)合磷酸鹽1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）作用時間對鱸魚肉品除了剪切力指標(biāo)，還有質(zhì)構(gòu)特性、肌原纖維蛋白降解及表面微觀結(jié)構(gòu)的影響，確定嫩化劑使用時間，建立改善鱸魚調(diào)理品品質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚、鹽、味精購于武漢市武商量販；木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/mg） 廣西南寧龐博生物工程有限

公司；焦磷酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、氯化鈣等均為食品級試劑 武漢泰晟生物科技有限公司；其他生化

試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-400色差儀 柯尼卡美能達(dá)株式會社；PB-10 pH計 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；CLM-3B肌肉嫩度儀 北京朋利馳科技有限公司；TA-XTPlus食品物性測試儀 英國Stable Micro System公司；DYY-I2電泳儀 北京六一儀器廠；QUANTA掃描電鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

河鱸魚→去頭尾、腮、鱗、內(nèi)臟→分塊→腌制嫩化→

速凍→冷藏→解凍→汽烹→制樣→指標(biāo)測定

1.3.2 原料處理

選用鱸魚背部肉，去魚皮，剔除原料中魚刺，清洗后瀝干，切成3 cm×1 cm×1 cm的條塊。用1%食鹽和0.5%味精均勻涂抹魚塊，隨機分成5 組，用嫩化劑（含氯化鈣1.2‰、復(fù)合磷酸鹽1.2‰及木瓜蛋白酶1.8‰）分別處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h后，-40 ℃速凍30 min，-20 ℃冷庫冷藏12 h，解凍后汽烹3 min。冷卻后制樣、檢測。

1.3.3 色差值及pH值測定

魚肉亮度L*、紅度a*、黃度b*用便捷式色差儀測定，色差儀在使用前用白板進(jìn)行校準(zhǔn)，對每一肉樣平行測定5 次。魚肉攪成肉泥后離心，取上清液，用便攜式pH計分別測量pH值，每組5 個平行。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性及剪切力測定

取2 cm高的肉樣，汽烹3 min，冷卻后用TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀測定硬度、彈性、黏性、咀嚼性、回復(fù)力等。測定條件：探頭P/36R，模式TPA，測試前速率2.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測試后速率1.0 mm/s，強度75%[11]。每個樣品平行測定6 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

取2.5 cm高的肉樣，汽烹3 min，冷卻后在CLM-3B嫩度儀上進(jìn)行肌肉剪切力測定[12]，當(dāng)切頭到達(dá)最低端的時候，記下儀器上顯示的數(shù)據(jù)。每個樣品5 個平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.5 肌原纖維小片化指數(shù)及肌原纖維蛋白表面疏水性測定

測定方法根據(jù)文獻(xiàn)[13]改進(jìn)。取適量樣品絞碎，每組準(zhǔn)確稱取2.0 g魚泥，放于50 mL離心管中，加入20 mL蛋白提取A液（含0.02 mol/L Tris-HCl和0.1 mol/L氯化鉀），在高速勻漿機上勻漿0.5 min，4 ℃離心20 min，棄上清液，重復(fù)3 次。得到的沉淀，加入20 mL蛋白提取B液（含0.02 mol/L Tris-HCl和0.6 mol/L氯化鉀），高速勻漿，4 ℃離心20 min，棄去沉淀。得到的上清液即為魚肉纖維蛋白提取液。纖維蛋白濃度用雙縮脲反應(yīng)來測定。將肌原纖維懸浮液稀釋，然后攪拌均勻，放入比色皿，采用紫外分光光度計于540 nm波長處測定吸光度。每0.5 mg/mL的肌原纖維蛋白的吸光度乘以200，得到的數(shù)值即為肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）。每個樣品3 個平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

吸取提取的蛋白溶液5 mL于500 mL的容量瓶中，分別配制成不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液（質(zhì)量濃度約在0.005～0.100 g/L），取不同質(zhì)量濃度的蛋白溶液各5 mL，加入8 mmol/L的8-苯氨基-1-萘磺酸溶液，然后振蕩均勻，放暗處靜置20 min。設(shè)置熒光光度計激發(fā)波長為390 nm，進(jìn)行發(fā)射波長在0～470 nm范圍內(nèi)的熒光強度掃描。記錄熒光強度，表征所測蛋白提取液中蛋白質(zhì)疏水性。每個樣品3 個平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.6 肌原纖維蛋白變化觀察

采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）研究不同嫩化時間下魚肉肌原纖維蛋白的變化[14]。采用垂直板式電泳槽，12%分離膠與4%濃縮膠，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加樣量為10 μL，待測樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL，加樣量為20 μL。先在60 mV的電壓下電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)整至100 mV左右，當(dāng)溴酚蘭指示帶接近膠底l cm時，停止電泳。小心將凝膠取下，用5%戊二醛固定1 h，置于染色容器中用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL）染色5～6 h，脫色液脫色1 h，膠片觀察燈上拍照記錄。

1.3.7 魚肉表面微結(jié)構(gòu)觀察（掃描電鏡）

魚肉樣品在2.5%戊二醛溶液中固定2 h，用0.1 mol/L

的磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）沖洗3 次，每次10 min。然后分別用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、95%和100%的乙醇脫水，每次10～15 min。用乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液浸泡15 min，再用叔丁醇浸泡15 min。固定好的魚肉置-70 ℃冷凍，用切片機切成薄片，冷凍干燥24 h[2]。將樣品送武漢大學(xué)測試中心用掃描電鏡進(jìn)行觀察。樣品用雙面膠黏于樣品臺上，用離子濺射器鍍鉑膜，膜厚度約為100 ?。測試條件為加速電壓10 kV，能量分辨率：Mn kα132 eV，放大倍數(shù)分別為80 倍，觀察并拍照具有代表性的表面微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

pH值、色差值及質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果采用IBM SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）進(jìn)行差異顯著性分析。剪切力、魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性和肌纖維小片化指數(shù)的數(shù)據(jù)結(jié)果，采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理并作圖，各數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Students t檢驗進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嫩化時間對鱸魚魚肉pH值及色差值的影響

由表1可知，隨著嫩化時間的延長，樣品pH值呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。嫩化劑作用0.5 h后魚肉pH值降至最低，作用1.5 h后魚肉pH值升至最高7.59±0.04，與對照組差異顯著（P<0.05）。這是因為復(fù)合磷酸鹽有助于魚肉pH值的提高，使肌肉中肌球蛋白和肌動蛋白偏離等電點（5.4）而溶解，促使魚肉嫩化。此外，肌肉pH值會影響鈣蛋白酶活性，高pH值有利于提高鈣蛋白酶活性，促進(jìn)魚肉嫩度提高[15]。

魚肉色差值L*代表肉樣的亮度值，該值越大肉光澤度越好，a*代表肉樣紅度值，b*代表肉樣黃度值，b*值越小表明肉越新鮮[16]。由表1可知，魚肉L*呈先下降后上升再下降的趨勢，在1.5 h時達(dá)到最高約57.06，與對照組差異顯著（P<0.05）。a*先下降后上升，嫩化1.5 h時a*值和對照組差異不顯著。b*先上升后下降，并在嫩化1.5 h時降至約0.34，顯著低于對照組（P<0.05）。以上結(jié)果表明，嫩化1.5 h時，魚肉色澤最好。

2.2 嫩化時間對鱸魚魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表2可知，魚肉的硬度、黏性、咀嚼性和回復(fù)力均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，嫩化1.5 h時出現(xiàn)最小值，并與對照組差異顯著（P<0.05），尤其硬度和黏性指標(biāo)降低幅度分別達(dá)57.38%和79.41%。這可能因為嫩化時間越長，木瓜蛋白酶作用使魚膠原降解、肌纖維斷裂[6]，另一方面，Ca2+濃度越高，鈣激酶活性增強，從而降解肌原纖維蛋白和連接蛋白[17]，因此魚肉硬度、黏度和咀嚼性下降。

2.3 嫩化時間對鱸魚魚肉剪切力的影響

Fig. 1 Tenderness of largemouth bass meat as a function of tenderization time

由圖1可知，魚肉剪切力隨嫩化時間的延長先下降后上升。嫩化1.5 h時，魚肉剪切力最小為（21.89±0.27） N，與對照組相比降低33.83%，差異極顯著（P<0.001）。這可能是綜合作用的結(jié)果：一是肌漿中Ca2+濃度提高，增強鈣激酶活性和縮短酶激活時間，進(jìn)而降解肌原纖維蛋白和連接蛋白，使剪切力下降[18]；

二是復(fù)合磷酸鹽能夠通過提高離子強度，促使肌球蛋白從肌原纖維中溶解出來，從而提高肉的保水性而增加肉品嫩度[19]；三是蛋白酶作用使肌纖維斷裂，肌肉纖維小片化程度加大[5]，魚肉剪切力下降。但作用時間超過1.5 h，魚肉剪切力上升，這是因為肌動球蛋白質(zhì)的過度裂解和結(jié)締組織的過分降解會造成肌肉超微結(jié)構(gòu)的過度破壞，導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)過于松散，保水性降低液體流失[20]，從而魚肉剪切力上升。

2.4 嫩化時間對鱸魚魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性和肌纖維小片化指數(shù)的影響

Fig. 2 Change in myofibrillar protein surface hydrophobicity and myofibrillar fragmentation index with tenderization time

由圖2可知，實驗組魚肉肌纖維蛋白表面疏水性增加，但與對照組無顯著差異（P>0.05）。肌纖維蛋白表面疏水性增加意味著蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，分子伸展開或斷裂，使得非極性的氨基酸殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面[21]。另一方面，魚肉嫩化1.0～2.0 h時肌原纖維小片化指數(shù)顯著增加，最高可達(dá)108.6±8.8，與對照組相比提高47.96%。肌原纖維小片化指數(shù)是衡量肉類嫩度的重要指標(biāo)[13]，代表肌原纖維蛋白質(zhì)水解的程度，其值增加表明實驗中魚肉肌纖維蛋白水解程度上升。

2.5 鱸魚魚肉肌原纖維蛋白的變化

Fig. 3 Myofibrillar protein bands of largemouth bass meat by SDS-PAGE

由圖3可知，鱸魚肉肌原纖維蛋白主要有8 個條帶，從上至下分別為：肌球蛋白重鏈（L鏈）、α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白、結(jié)蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白亞基、及肌球蛋白堿性輕鏈，該結(jié)果與Teixeira等[14]的報道一致。嫩化導(dǎo)致魚肉肌原纖維蛋白成分發(fā)生了變化，嫩化1.5 h后分子質(zhì)量38 kD的蛋白和原肌球蛋白減少，在約37 kD處左右產(chǎn)生了新的蛋白條帶（圖3白框標(biāo)注處）。大分子蛋白降解與鈣激酶和木瓜蛋白酶的酶解作用有關(guān)，也與肌纖維小片化指數(shù)升高結(jié)果相符合。

2.6 鱸魚魚肉嫩化前后表面微觀結(jié)構(gòu)觀察

Fig. 4 Surface microstructure of largemouth bass meat at different tenderization times by scanning electron microscope （× 80）

鱸魚肌肉微觀結(jié)構(gòu)包括肌纖維的直徑、密度、肌纖維間組織等[22]。由圖4A可知，不加嫩化劑的魚肉纖維較細(xì)、肌纖維密度大、排列緊密。由圖4B可知，嫩化0.5 h，魚肉肌纖維結(jié)構(gòu)完整但肌纖維變粗、纖維密度變小，纖維間連接組織少，這跟肉眼觀察到的嫩化后魚肉塊變大結(jié)果相印證。此階段可能主要為復(fù)合磷酸鹽作用，加快了魚肉肌原纖維中的肌球蛋白和肌動蛋白溶解[23]，

魚肉持水性增加。由圖4C、D可知，嫩化1.0～1.5 h，魚肉肌纖維有斷裂現(xiàn)象，纖維表面肌束膜不明顯，該實驗結(jié)果與蛋白酶水解牛肉結(jié)果相符[5]。此階段主要是酶的作用，魚肉內(nèi)源酶——鈣激酶活性增加，導(dǎo)致魚肉肌原纖維崩裂，從而使肌節(jié)部位斷裂[24-25]，此外外源酶——木瓜蛋白酶的作用也顯現(xiàn)，并通過先水解膠原再水解肌原纖維蛋白的方式來提高肉品嫩度[13]。由圖4E可知，嫩化2.0 h，魚肉有糜化現(xiàn)象，這是由于長時間酶解導(dǎo)致肌纖維和結(jié)締組織被過度降解[26]。

3 結(jié) 論

用復(fù)合嫩化劑（氯化鈣1.2‰、復(fù)合磷酸鹽1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）嫩化鱸魚半成品1.0～1.5 h，可顯著降低魚肉剪切力和硬度，提高魚肉pH值和亮度，并增加魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性和肌原纖維小片化指數(shù)。

SDS-PAGE結(jié)果表明，嫩化后魚肉肌原纖維中分子質(zhì)量38 kD的蛋白和原肌球蛋白發(fā)生降解；掃描電鏡結(jié)果表明，嫩化1.0～1.5 h后魚肉組織變得蓬松、肌纖維間連接物消失、肌肉纖維發(fā)生斷裂。該嫩化劑效果良好，嫩化1.0～1.5 h可顯著提升魚肉半成品嫩度與口感，適合工業(yè)生產(chǎn)中使用。

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