張志剛 劉栓桃 李巧云 王曉 王立華 趙智中 王淑芬 徐文玲 劉賢嫻 劉辰

摘要：本研究利用春季和秋季條件下光周期的變化趨勢，對兩個(gè)大白菜自交系06-247與He102的光周期敏感性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果是06-247對長日照敏感，而He102對長日照不敏感。采用同源克隆技術(shù)，比較分析兩材料光周期響應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控因子CCA1的全長cDNA序列，發(fā)現(xiàn)二者編碼區(qū)存在兩處6 bp插入/缺失和14處非同義SNPs差異；二者編碼產(chǎn)物分別包含552、556個(gè)氨基酸殘基；其非同義SNPs造成不同氨基酸的替換；二者間氨基酸序列差異主要位于CCA1蛋白中間區(qū)域的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域和C端的磷酸化修飾結(jié)構(gòu)域。本研究開發(fā)出區(qū)分兩處6 bp插入/缺失的共顯性分子標(biāo)記。該結(jié)果為深入研究CCA1在大白菜光周期響應(yīng)調(diào)節(jié)過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜； 依賴/不依賴長日照開花型；BraCCA1；插入/缺失突變；功能標(biāo)記

中圖分類號：S634.103.6文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0001-06

對春白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis） 而言，耐抽薹是一個(gè)至關(guān)重要的指標(biāo)。抽薹之后必然伴隨開花，因此抽薹屬于大白菜開花途徑的一個(gè)發(fā)育過程。大白菜與模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）同屬十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），因此有關(guān)擬南芥開花途徑的分子機(jī)制研究結(jié)果對大白菜相關(guān)研究有較大借鑒價(jià)值。對擬南芥開花途徑的分子機(jī)制研究表明，植物的開花受四條途徑控制，即春化途徑、光周期途徑、自主途徑和赤霉素途徑[1]。大白菜屬于兩年生長日照植物，在長期進(jìn)化過程中，適應(yīng)了當(dāng)年秋季結(jié)球、次年春季抽薹開花的特性，因此它由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變除了需要明顯的環(huán)境低溫外，還需要相對較長的日照，即春化和長日照是誘導(dǎo)大白菜開花的主要環(huán)境因子[2]。在春白菜生產(chǎn)實(shí)踐中，春季溫度波幅較大，且常有倒春寒的影響，春化難以避免，而日照長度的變化則隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)恒定的變化趨勢，是變化穩(wěn)定的環(huán)境因子。所以選出的長日照依賴型晚抽薹比耐低溫晚抽薹的大白菜材料在生產(chǎn)上表現(xiàn)更穩(wěn)定，有望創(chuàng)制出更耐抽薹的大白菜種質(zhì)。

抽薹開花的光周期調(diào)控途徑涉及復(fù)雜的晝夜節(jié)律鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，晝夜節(jié)律鐘核心震蕩子包括 CCA1 和 LHY 兩個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子，二者同源性較高，以同源或者異源二聚體結(jié)合于目的基因啟動子區(qū)的相應(yīng)元件發(fā)揮作用[3]。CCA1和LHY單基因功能缺失突變體都有短日照下早抽薹開花的表型，可以縮短光周期2～3 h[4]。擬南芥中的CCA1包含663個(gè)氨基酸殘基，N端第11～82位氨基酸殘基是MYB結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與啟動子元件結(jié)合[5]；第136～316位氨基酸殘基與蛋白二聚化有關(guān)，負(fù)責(zé)蛋白-蛋白相互作用；C端是磷酸化調(diào)節(jié)區(qū)，其中的絲氨酸殘基是潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)[6]。凡是能夠影響上述關(guān)鍵功能域結(jié)構(gòu)的氨基酸突變都有可能影響CCA1的功能，從而影響其介導(dǎo)的光周期開花響應(yīng)。研究者分別從楊樹、大麥、玉米[7～9]等植物中克隆出相應(yīng)的CCA1，分子進(jìn)化關(guān)系表明，它們在單雙子葉植物間非常保守，其N端的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度高達(dá)79%以上，而鮮見同一物種中基因多樣性的報(bào)道。本研究從不同光周期依賴型大白菜材料中分別克隆了CCA1全長cDNA，發(fā)現(xiàn)二者編碼區(qū)存在兩處插入/缺失突變，利用生物信息學(xué)技術(shù)對其氨基酸序列進(jìn)行分析，開發(fā)出區(qū)分這兩處插入/缺失突變的共顯性標(biāo)記，旨在為利用CCA1基因突變培育耐抽薹春白菜提供理論依據(jù)和可供選擇的標(biāo)記。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

耐抽薹大白菜自交系06-247是市售日本春白菜F1的自交分離系，易抽薹大白菜自交系He102是我國地方品種“河南二包頭”的自交分離系。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1光周期敏感試驗(yàn)試驗(yàn)于2010年至2013年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所核心試驗(yàn)基地進(jìn)行，常規(guī)管理。試驗(yàn)一（長日照）：2010年8月10日正常播種，田間常規(guī)管理，11月21日采收健康母株，11月30日定植于日光溫室；試驗(yàn)二（長日照）：2012年12月28日催芽育苗，2013年3月7日定植于紗棚；試驗(yàn)三（短日照）：2013年6月采收的飽滿種子，浸種催芽后將萌動的種子置于4℃冰箱春化處理35天，8月20日播種于含營養(yǎng)土（基肥∶壤土∶蛭石=1∶1∶1）的花盆內(nèi)。每材料播種5～10株。所有試驗(yàn)常規(guī)肥水管理，隨時(shí)觀察長勢，記錄現(xiàn)蕾期、始花期，薹高（短縮莖長）的調(diào)查與測量參照余洋俊[10]和張德雙[11]等的方法，取平均值，以厘米（cm）為單位，并用DPS軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.2.2CCA1的全長cDNA克隆及序列分析大白菜幼苗長至二葉一心期時(shí)，取真葉組織約1 g立即置液氮中研磨、Trizol （Invitrogen Cat. No. 15596-026）法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 （天根試劑盒KR104并按說明書操作）。用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)BRAD數(shù)據(jù)庫中CCA1的參考序列設(shè)計(jì)基因特異性引物（pF1：5′-TCGAGTGGTTCTAGTTTCTCAATCG-3′，pR1：5′-AAGACTATGGACAAAATACACAGGC-3′），以cDNA為模板用高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：5×HF Buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 μmol/L，下同） pF1 1 μL，引物 pR1 1 μL，全式金高保真酶 （北京全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase，AP221-01） 1 μL，模板1 μL，ddH2O 32 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性 20 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 90 s，循環(huán) 35 次；72℃后延伸 5 min。用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，確認(rèn)有特異性目的條帶后取1 μL PCR產(chǎn)物和1 μL平端載體（北京全式金pEasy-Blunt，CB101-01）于室溫（25℃）進(jìn)行15 min的連接反應(yīng)。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金，CD501-01），菌落PCR檢測陽性克隆，取陽性克隆送北京華大基因有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。序列分析采用DNAMAN軟件進(jìn)行。

1.2.3功能標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用針對兩材料中CCA1編碼區(qū)兩處InDels差異，在其兩端分別設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為PF1： 5′-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3′，PR1：5′-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3′；PF2：5′-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3′，PR2：5′-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物用6.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染照相。用開發(fā)的標(biāo)記檢測部分大白菜材料，驗(yàn)證標(biāo)記的實(shí)用性。

2結(jié)果與分析

2.1光周期敏感性鑒定

光周期敏感性調(diào)查結(jié)果見表1。由試驗(yàn)一和試驗(yàn)二可知，He102與06-247在春分節(jié)氣前（短日照條件下）都可以正?，F(xiàn)蕾，表明春分前的低溫足以使二者通過春化，但06-247現(xiàn)蕾時(shí)間明顯晚于He102。二者始花期出現(xiàn)的時(shí)間亦顯著不同，試驗(yàn)一中He102始花期介于2月中旬，此時(shí)花薹長達(dá)23 cm左右，表明He102在短日照條件下可以正常抽薹開花，也說明該材料抽薹開花不依賴長日照；06-247則不然，其始花期在春分以后的3月下旬，且此時(shí)花薹極短，二者始花期薹高差異極顯著。另外，從試驗(yàn)一的田間觀察發(fā)現(xiàn)，06-247始花期時(shí)花粉極少，人工輔助授粉難以結(jié)莢，說明日照相對較短時(shí)花粉生活力較差，要等到4月中下旬，日照時(shí)數(shù)接近14 h時(shí)其花粉才能發(fā)育正常。由此可見，06-247抽薹開花依賴于長日照。試驗(yàn)三的結(jié)果進(jìn)一步表明，短日照條件下（9月下旬秋分后），He102在通過春化后可以正常抽薹開花，而06-247雖然可以分化花芽，但始終沒有抽薹，花蕾也不能開放，甚至出現(xiàn)結(jié)球現(xiàn)象。綜上所述，He102的現(xiàn)蕾、抽薹和開花均不依賴長日照，06-247的現(xiàn)蕾對長日照依賴性不強(qiáng)、而抽薹和開花則必須在長日照下才能進(jìn)行。由此推斷，大白菜的花芽分化（現(xiàn)蕾）與抽薹開花可能受不同的基因控制，屬于不同的農(nóng)藝性狀。利用自然日照長短的變化，將試驗(yàn)一/二與試驗(yàn)三結(jié)合，可以有效鑒定大白菜抽薹開花對長日照的依賴性。

2.2CCA1全長cDNA克隆及氨基酸序列分析

CCA1是模式植物擬南芥中調(diào)控光周期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，因此本研究采用同源克隆技術(shù)克隆了兩材料中CCA1全長cDNA，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。經(jīng)測序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)長日照依賴型耐抽薹材料06-247的CCA1編碼區(qū)長1 659 bp，與BRAD數(shù)據(jù)庫中Chifu-401的序列完全同源，而來自長日照不依賴型極易抽薹材料He102的CCA1編碼區(qū)長1 671 bp。后者除了比前者多兩處6 bp的插入外，整個(gè)編碼區(qū)還有23處SNPs（圖2A），其中14處是非同義突變，造成不同氨基酸的替換突變（圖2B）。經(jīng)預(yù)測，前者編碼產(chǎn)物包含552個(gè)氨基酸殘基，后者包含556個(gè)，二者分子量分別是60.14 kD和60.58 kD。

圖206-247與He102的CCA1編碼區(qū)序列（A）及氨基酸序列（B）比較依據(jù)全長cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列差異見表2。在兩材料CCA1全長cDNA之間的兩處6 bp插入/缺失中，第一處是t.329_330 ins CGGAAG，使He102的CCA1 蛋白第112位后的氨基酸插入Gly和Ser兩個(gè)殘基；第二處是t.1407_1408 ins CAACAA，導(dǎo)致He102的CCA1在469位氨基酸之后插入兩個(gè)Gln （圖2B）。其余非同義突變造成不同氨基酸的替換，其中性質(zhì)差異較大的有118 Pro>Thr、119 Gly>Cys、125 Glu>Gln、176 Asn>Lys、440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、465 Lys>Gln、467 Glu>Lys。另外，440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、528 Ser>Asn、529 Asn>Ser與絲氨酸的替換有關(guān)，是潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)。

根據(jù)擬南芥CCA1的結(jié)構(gòu)域分布特點(diǎn)，He102中的突變位點(diǎn)主要位于第113位氨基酸之后，主要在蛋白-蛋白相互作用區(qū)和磷酸化修飾區(qū)。上述性質(zhì)差異較大的氨基酸替換突變，位于蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的有可能影響CCA1的空間折疊結(jié)構(gòu)，而位于C端與絲氨酸有關(guān)的四處突變可能影響磷酸化修飾位點(diǎn)。

2.3基于小片段插入缺失的共顯性標(biāo)記開發(fā)

06-247與He102的CCA1編碼區(qū)兩處小片段插入/缺失大小僅為6 bp，一處靠近5′端，另一處靠近3′端。在突變區(qū)域兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，使擴(kuò)增片段介于100～200 bp間，用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳對擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3A，表明6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠很好地區(qū)分6 bp的差異。用其中位于3′端的標(biāo)記檢測了部分大白菜資源（圖3B），從圖中可以看出，所開發(fā)的標(biāo)記擴(kuò)增條帶清晰、沒有雜帶干擾，適合用于種質(zhì)資源的基因型篩查。

3討論與結(jié)論

耐抽薹大白菜種質(zhì)的創(chuàng)新是春白菜育種的關(guān)鍵，而耐抽薹性狀的正確評價(jià)及有效篩選直接關(guān)系到耐抽薹種質(zhì)的創(chuàng)新效率。大白菜耐抽薹性狀的評價(jià)方法較多，大都采用不同的低溫春化處理，根據(jù)處理一定時(shí)間后材料的現(xiàn)蕾和開花早晚來判斷其耐抽薹性，且一般將現(xiàn)蕾期、始花期和始花期薹長共同作為判定耐抽薹的標(biāo)準(zhǔn)[10，11]。這在一定程度上增加了耐抽薹性狀QTL定位研究的復(fù)雜性，難以得到精細(xì)的定位結(jié)果。如張磊[12]利用類似的耐抽薹鑒定方法定位了9個(gè)與耐抽薹有關(guān)的QTLs，于拴倉[13]則定位了6個(gè)。有的研究者雖然注意到光周期對一些大白菜抽薹開花有影響，也發(fā)現(xiàn)現(xiàn)蕾和抽薹不一致[14，15]，但并未提出長日照依賴型抽薹開花的概念，仍將現(xiàn)蕾、抽薹、開花綜合作為耐抽薹性狀。本研究首次發(fā)現(xiàn)06-247與He102現(xiàn)蕾和抽薹是兩個(gè)獨(dú)立的性狀，為下一步耐抽薹性狀精細(xì)解析和精準(zhǔn)定位奠定了基礎(chǔ)。本研究試驗(yàn)二和試驗(yàn)三相結(jié)合，可以有效判定大白菜材料的抽薹開花是否依賴長日照，為長日照依賴型表型鑒定提供了新的方法。

自然界日照長短是恒定變化的環(huán)境因子，植物為了響應(yīng)光周期的變化，進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。本研究基于模式植物擬南芥光周期誘導(dǎo)開花的調(diào)控機(jī)制，從光周期關(guān)鍵調(diào)控因子CCA1著手，發(fā)現(xiàn)06-247與He102的CCA1在蛋白-蛋白結(jié)合區(qū)和磷酸化修飾區(qū)存在氨基酸插入/缺失和替換突變。這可能導(dǎo)致兩者CCA1蛋白功能的差異，從而導(dǎo)致兩材料對光周期敏感程度不同，即CCA1是潛在的光周期調(diào)控關(guān)鍵功能基因?；诰幋a區(qū)小片段插入/缺失的差異，本研究開發(fā)出區(qū)分兩個(gè)大白菜品種的共顯性分子標(biāo)記，該標(biāo)記位于功能基因內(nèi)部，是潛在的功能標(biāo)記，為下一步耐抽薹種質(zhì)篩選、耐抽薹大白菜新品種輔助育種及耐抽薹性狀精細(xì)定位研究提供了可供選擇的標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jung C， Muller A E. Flowering time control and applications in plant breeding [J]. Trends in Plant Science， 2009，14： 563-573.

[2]張振賢.蔬菜栽培學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：242-245.

[3]Huang W， Pérez-García P， Pokhilko A， et al. Mapping the core of the Arabidopsis circadian clock defines the network structure of the oscillator [J]. Science， 2012， 336：75-79.

[4]Hayama R， Coupland G. Shedding light on the circadian clock and the photoperiodic control of flowering[J]. Curr. Opin. Plant Biol.， 2003， 6（1）：13-19.

[5]Wang Z Y， Kenigsbuch D， Sun L， et al. A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of an Arabidopsis Lhcb gene [J]. Plant Cell， 1997，9：491-507.

[6]Daniel X， Sugano S， Tobin E M.CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis[J]. PNAS， 2004，101： 3292-3297.

[7]劉無雙，杜明會，陶維康，等. 楊樹生物鐘節(jié)律基因PtCCA1 的克隆及表達(dá)模式研究[J].林業(yè)科學(xué)研究， 2013，26（5）：649-654.

[8]邢國芳，宋萌，姚涵，等. 大麥晝夜節(jié)律鐘基因CCA1的克隆及表達(dá)分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012， 32（3）：207-212.

[9]邢國芳，杜偉建，張雁明，等.玉米晝夜節(jié)律鐘基因CCA1的克隆及表達(dá)分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，31（4）：332-337.

[10]余陽俊，趙岫云，徐家炳，等. 大白菜室內(nèi)苗期耐抽薹鑒定方法[J].中國蔬菜， 2002（1）：29-30.

[11]張德雙，徐小謝，徐家炳. 春化天數(shù)對大白菜、小白菜現(xiàn)蕾和開花的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2003， 18（1）： 75-78.

[12]張磊.白菜抽薹相關(guān)性狀QTL定位分析[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[13]于拴倉.大白菜分子遺傳圖譜的構(gòu)建及重要農(nóng)藝性狀的QTL定位[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2003.

[14]余陽俊， 張鳳蘭，趙岫云，等. 光周期與夜間補(bǔ)光光強(qiáng)對蕓薹種抽薹開花的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（6）：114-118.

[15]惠麥俠. 大白菜耐抽薹性及其鑒定方法的研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2002.