張坤鵬 孫瑞紅 楊洪強

摘要：為明確山楂葉螨、二斑葉螨和蘋果全爪螨脅迫對富士蘋果葉片細胞超微結構及山楂葉螨脅迫對葉片游離脯氨酸含量的影響，利用透射電鏡觀察了上述3種害螨取食6 d 時葉片細胞超微結構的變化，并采用酸性茚三酮法測定了游離脯氨酸含量。結果顯示，正常蘋果葉片細胞呈長方形，大小相近，細胞排列整齊，細胞質中細胞器分布有序，細胞界限清晰；細胞內葉綠體數(shù)量較多，呈船形，緊貼細胞壁分布；細胞核呈長橢圓形，核仁和核膜清晰可見；細胞膜和細胞壁完整，相鄰細胞壁界限明顯。葉片被害螨刺吸為害后，葉肉細胞內部結構嚴重受損，細胞間隙增大，葉綠體和細胞核變形，葉綠體內有淀粉粒出現(xiàn)，嚴重影響細胞功能。山楂葉螨為害后的細胞壁上出現(xiàn)針狀結晶沉淀物。山楂葉螨刺吸取食過程中，蘋果葉片內游離脯氨酸含量隨受害時間延長和螨口密度提高總體呈先升后降的趨勢。害螨為害可破壞蘋果葉片細胞超微結構，導致細胞功能喪失，抗逆性物質游離脯氨酸含量的升高表明蘋果葉片對山楂葉螨取食的對抗。

關鍵詞：富士蘋果；山楂葉螨；二斑葉螨；蘋果全爪螨；細胞超微結構；游離脯氨酸

中圖分類號：S661.103.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0036-06

山楂葉螨Tetranychus viennensis、二斑葉螨T. urticae和蘋果全爪螨Panonychus ulmi是為害蘋果葉片的3種重要害螨[1]，廣泛分布于我國各蘋果產區(qū)，造成葉片光合作用下降甚至提前落葉，抑制樹體生長和花芽形成，給蘋果生產造成嚴重損失。

植物生長發(fā)育過程中常會遭遇不同逆境脅迫，逆境脅迫可分為生物、化學脅迫和物理脅迫3類，蟲害脅迫屬于典型的生物脅迫[2]。植物被刺吸性害蟲取食后，葉肉細胞會產生生理、生化及形態(tài)結構等一系列生物學變化。研究表明，褐飛虱Laodelphax striatellus為害水稻稻葉后，會引起葉片細胞質壁分離、葉綠體異常發(fā)育、結構松散，膜結構最終溶解或斷裂[3，4]。梨網(wǎng)蝽Stephanitis nashi為害梨葉后，葉肉細胞中葉綠體膜被破壞，片層結構排列松散，最終瓦解，個別細胞線粒體內部嵴數(shù)目減少，基質變稀薄，有些細胞葉綠體內出現(xiàn)淀粉粒，嚴重時細胞凋亡，只剩殘片[5]。桔始葉螨Eotetranychus kankitus為害柑桔葉片后，導致葉片葉綠體膜缺損，淀粉粒異常膨大，基粒片層排列不規(guī)則，甚至消失，嗜鋨顆粒數(shù)目明顯增多[6]。朱砂葉螨T. cinnabarinus為害棉葉后，葉綠體膜逐漸溶解，基粒片層排列混亂，片層結構消失，淀粉粒增多，有些細胞被完全破壞[7]。桑始葉螨Eotetranychus suginamensis為害桑葉后，葉綠體外被膜出現(xiàn)多處斷裂，基粒片層和基質片層排列雜亂并產生較大空洞，細胞質中出現(xiàn)致密顆粒和膜狀物[8]。

植物體內游離脯氨酸含量常作為評價植物抗逆性高低的一項生理指標。菜豆葉片游離脯氨酸含量隨二斑葉螨為害時間延長明顯增加[9]。番茄刺皮癭螨Aculops lycopersici為害后，番茄葉片游離脯氨酸含量急劇升高，并且隨為害時間延長和接螨量增加而持續(xù)上升[10]。梨癭螨Eriophyes pyri和梨葉銹癭螨Epitrimerus pyri為害后，梨樹葉片游離脯氨酸含量明顯上升，并隨受害程度逐漸加重。游離脯氨酸含量升高主要集中在為害部位，同時也會引起受害部位周圍組織游離脯氨酸含量上升[11]。梨葉銹癭螨取食蘋果梨葉片引起的游離脯氨酸含量的變化與竇彩虹的研究結果相似[12]。臭椿被太行癭螨Aculops taihangensis為害后，葉片內游離脯氨酸含量增加，反映出臭椿對太行癭螨的抵抗，但螨口數(shù)量的增長會終止游離脯氨酸含量上升[13]。梅下毛癭螨Acalitus phloeocoptes為害杏樹嫩芽后，受害芽的游離脯氨酸含量最高上升69.44%[14]。

目前，關于蘋果葉片受到害螨為害后細胞超微結構及游離脯氨酸含量變化的研究尚未見報道。為此，本研究進行了這方面的試驗，旨在為研究富士蘋果對害螨為害的響應機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試樹網(wǎng)室內的盆栽蘋果樹，品種為短枝富士，樹齡3年。

1.1.2供試螨山楂葉螨、二斑葉螨和蘋果全爪螨均采自山東省泰安市郊區(qū)蘋果園。然后連續(xù)飼養(yǎng)于室內盆栽海棠苗上，養(yǎng)蟲室條件為溫度（26±1）℃，相對濕度（60±10）%，光周期12 L∶12 D。

1.2試驗方法

1.2.1細胞超微結構觀察選擇健康盆栽蘋果苗，按10頭/葉的螨口密度分別將上述3種害螨的雌成螨接到不同植株的成熟葉片上，在葉柄處涂抹凡士林防止螨逃逸，每種害螨接2株樹，重復3次，空白對照不接螨。

接螨6 d時，分別剪取處理葉片及對照葉片。在葉片葉螨刺吸點處切取0.5 mm2小塊，迅速置于4%戊二醛溶液中進行固定。用注射器抽氣3次，固定后用pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液漂洗，然后用1%鋨酸固定，再用乙醇-丙醇梯度脫水。之后用Epon 812環(huán)氧樹脂滲透包埋，使用LKB-5型超薄切片機切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，置于JEM-1200EX型透射電鏡下觀察細胞超微結構并拍照。

1.2.2游離脯氨酸含量測定分別將山楂葉螨雌成螨按10、20、30 頭/葉3個螨口密度接到不同植株的成熟葉片上，每處理4株，重復3次，葉柄處涂抹凡士林防止螨逃逸。以不接螨處理做空白對照。分別在為害6、8、10 d時摘取各處理葉片，于-24℃低溫保存。

酸性茚三酮試劑：稱取茚三酮2.5 g，加入冰乙酸60 mL和6 mol/L磷酸40 mL，于70℃加熱溶解，冷卻后儲于棕色試劑瓶中，冰箱內4℃保存。

稱取10 mg脯氨酸溶于少量80%乙醇溶液內，蒸餾水定容至100 mL，濃度為100 μg/mL。分別吸取0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mL放入50 mL容量瓶內，蒸餾水定容，配成0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL標準液。分別吸取各標準液2 mL、冰乙酸2 mL、茚三酮試劑2 mL放入10 mL帶塞刻度試管內，在沸水中放置15 min，取出后于520 nm光波處測定吸光值。以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

稱取蘋果葉片0.3 g，剪碎，加入適量80%乙醇液和少量石英砂研磨成漿，轉移至10 mL帶塞刻度試管內，用80%乙醇液洗滌殘渣，定容至10 mL，80℃水浴提取20 min。提取液中加入1勺人造沸石和適量活性炭，強烈振蕩5 min以去除干擾的氨基酸，過濾。

按照標準曲線測定方法對試樣進行測定，每處理重復測定3次，利用標準曲線和游離脯氨酸含量計算公式計算游離脯氨酸含量，用Duncans新復極差檢驗法進行差異顯著性分析。

脯氨酸含量（μg/gFW）=X×VFW

式中，X為根據(jù)標準線算得的樣品濃度值（μg/mL），V為樣品液總體積（mL），F(xiàn)W為樣品鮮重（g）。

2結果與分析

2.1蘋果葉片細胞超微結構變化

2.1.1正常葉片的細胞學特征正常蘋果葉片表皮和葉肉細胞呈長方形，大小相近，細胞排列整齊，細胞質中細胞器分布有序，細胞間隙明顯。細胞內葉綠體數(shù)量較多，呈船形，緊貼細胞壁分布。細胞核呈長橢圓形，核仁和核膜清晰可見。細胞膜和細胞壁完整，相鄰細胞壁界限明顯（圖1）。

2.1.2山楂葉螨為害葉片的細胞學特征山楂葉螨刺吸為害蘋果葉片6 d，葉肉細胞嚴重變形，細胞間隙變大，細胞器散亂于細胞質內，細胞內容物溢出，有些細胞僅在細胞壁周圍殘存一些碎屑，幾乎成為空胞（圖2A、E）。葉綠體內出現(xiàn)淀粉粒，腫脹趨于圓球狀，甚至葉綠體膜消失，葉綠體溶解散亂在細胞質中（圖2A、B）。細胞核被其他細胞器擠壓變形，細胞膜逐漸消失，細胞核解體（圖2C）。細胞壁分解斷裂，相鄰細胞壁界限逐漸模糊，最終消失形成空胞（圖2B、C、D、E），甚至緊鄰柵欄組織的上表皮細胞壁也分解斷裂（圖2D），有些細胞壁上附著針狀結晶沉淀物（圖2F）。

2.1.3二斑葉螨為害葉片的細胞學特征二斑葉螨為害6 d，蘋果葉片細胞受到不同程度破壞，細胞質減少，細胞間隙增大，葉綠體縮短膨脹變形，葉綠體中可見大量淀粉粒存在，細胞核核膜界限不清（圖3A），受害嚴重的細胞幾乎完全被破壞，細胞器降解甚至消失，細胞壁溶解斷裂，彎曲變形，細胞器殘渣外溢到細胞間隙內（圖3A、B、C）。

2.1.4蘋果全爪螨為害葉片的細胞學特征蘋果全爪螨為害6 d，蘋果葉肉細胞內部結構發(fā)生巨大變化，葉綠體由長橢圓形變?yōu)榻鼒A形，其內有淀粉粒沉積，受害嚴重的細胞結構幾乎完全被破壞，細胞器只剩殘渣或消失，只剩細胞壁殘余框架（圖4A）。細胞壁界限趨于模糊，細胞器殘余物從細胞壁缺口處溢出細胞（圖4B、C）。

2.2葉片內游離脯氨酸含量變化

2.2.1游離脯氨酸標準曲線經過Microsoft Excel分析確定，脯氨酸標準回歸方程為Y=0.0365X-0.0237，R2=0.9964。其中Y為520 nm的吸光值，X為脯氨酸濃度（μg/mL）。

2.2.2山楂葉螨為害對蘋果葉片游離脯氨酸含量的影響從表1可知，與對照葉片相比，在山楂葉螨為害期內，蘋果葉片中的游離脯氨酸含量發(fā)生明顯變化。為害6 d時，受害葉片內游離脯氨酸含量隨螨口密度的增加而上升，顯著高于對照的游離脯氨酸含量。但為害8、10 d時，脯氨酸含量隨螨口密度的增加而降低。

山楂葉螨螨口密度較低時（10 頭/葉），葉片中游離脯氨酸含量隨為害時間延長持續(xù)升高，為害10 d的含量最高，是對照葉片含量的1.79倍。隨著螨口密度的增加，游離脯氨酸含量隨為害時間延長下降，為害8、10 d時，30 頭/葉含量低于對照葉片。

3討論與結論

葉螨為害可對植物產生諸多影響，如葉綠素含量[15，16]，糖類和礦物質元素含量[15，17，18]，蛋白質、氨基酸含量[9，17]，抗氧化酶活性[9，19]，蛋白酶抑制劑活性[20，21]，光合作用、蒸騰作用[15，22，23]等變化明顯，同時，葉片細胞超微結構也會發(fā)生顯著變化[3，8]。葉綠體是植物完成光合作用的場所，其結構完整是保證光合作用正常進行的前提，而其對逆境脅迫比較敏感[24，25]。本研究結果表明，富士蘋果葉片葉肉細胞對3種害螨脅迫反應敏感的細胞器均為葉綠體，受害后的葉綠體形狀發(fā)生改變，排列趨于混亂，內部結構被損壞。相關研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體是植物細胞中產生活性氧的重要場所之一[26]。在害螨脅迫下，植物會產生過多活性氧，造成細胞水平的氧傷害，葉綠體、線粒體等細胞器功能損害，DNA等其他生物大分子降解和失活，最終誘發(fā)細胞過敏性壞死[19，27]。

植物細胞內的淀粉粒由光合作用產生，其運輸一般以蔗糖-Pi形式進行[28]。隨著害螨對葉肉細胞膜系統(tǒng)的破壞，光合作用產物輸送受阻，導致在葉綠體中積累大量淀粉粒。本研究在對山楂葉螨為害的富士蘋果葉片細胞進行超微結構觀察時，發(fā)現(xiàn)針狀結晶沉淀物，該類物質可能在抵抗山楂葉螨刺吸脅迫中具有重要作用，是富士蘋果對山楂葉螨為害防衛(wèi)機制的一種表現(xiàn)形式。

游離脯氨酸作為植物體內重要的滲透調節(jié)物質之一，其含量高低與植物抗逆能力有關[29]。葉片中的游離脯氨酸含量與其相對含水量呈明顯負相關[30]，其含量的增加是引起滲透勢下降的一個關鍵因素，有助于細胞或組織保持水分，維持蛋白質、膜和亞細胞結構的穩(wěn)定。湯章城[31]和Hare等[32]研究顯示，逆境下植物體內游離脯氨酸含量往往會升高。山楂葉螨為害初期，蘋果葉片細胞沒有受到嚴重破壞，會通過產生游離脯氨酸對抗葉螨，故葉片內的游離脯氨酸含量上升，這也說明蘋果葉片能夠通過游離脯氨酸的累積避免細胞受到滲透脅迫的傷害。隨著山楂葉螨數(shù)量增加和為害程度加重，當超過蘋果葉片所承受的范圍時，蘋果葉片滲透調節(jié)機制失效，游離脯氨酸含量下降，甚至低于對照。

本研究只做了3種蘋果害螨在10 頭/葉下為害6 d對富士蘋果葉片細胞超微結構的影響，不同為害時間及不同蘋果品種在不同葉螨為害下的細胞超微結構變化情況仍待進一步研究。前人研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸能夠參與植物葉綠素合成[31]，其含量的變化是否有利于蘋果葉片通過光合作用對螨害進行營養(yǎng)補償值得進一步研究。

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