李洪振 宋金鵬?┝醵?升 胡文剛 宮文萍 劉成 韓冉 劉建軍

摘要：microRNA（miRNA）是真核生物體內(nèi)普遍存在的一類具有重要調(diào)控功能的非編碼小分子RNA（sRNA）。研究表明，miRNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。截至目前，對(duì)植物miRNA的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但小麥miRNA研究才剛具雛形。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和sRNA高通量測(cè)序手段，已得到部分小麥miRNA。小麥miRNA的功能研究方法也有了初步結(jié)果。本文就小麥miRNA的識(shí)別、時(shí)空表達(dá)特性、抗逆相關(guān)特性及其功能研究方法進(jìn)行總結(jié)分析，為今后小麥miRNA的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：miRNA；小麥；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S512.101文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）06-0147-05

microRNA（miRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的真核生物體內(nèi)普遍存在的一類具有重要調(diào)控功能的非編碼小分子RNA（sRNA），其長(zhǎng)度在20～25 bp之間。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。迄今，植物miRNA的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 21： June 2014； http：//www.mirbase.org）中登錄注冊(cè)的植物成熟miRNA已有10 892條，其中絕大多數(shù)miRNA來(lái)自全基因組序列已知的水稻（713條）、擬南芥（427條）、二穗短柄草（525條）和玉米（321條）等物種。相比之下，小麥染色體組復(fù)雜，基因組龐大，全基因組測(cè)序雖已完成[1]，但序列組裝尚待完成，在miRBase中登錄注冊(cè)的miRNA僅有119條。因此，小麥miRNA研究還需進(jìn)一步加強(qiáng)。本研究就植物miRNA的生物合成，小麥miRNA的識(shí)別、時(shí)空表達(dá)特性、抗逆相關(guān)特性及其功能研究方法進(jìn)行了總結(jié)。

1植物miRNA的生物合成

和動(dòng)物miRNA不同，大部分植物miRNA基因定位于基因間區(qū)域，不成簇聚集[2]，其在基因組上具有一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元，可加工成多條miRNA。miRNA在植物體內(nèi)的合成較為復(fù)雜，需要多種酶和功能蛋白的參與。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的作用下轉(zhuǎn)錄成一條或多條初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primiRNA），隨后，與RNA結(jié)合蛋白DAWDLE（DDL）結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核加工中心（Dbody），在雙鏈RNA酶結(jié)合蛋白（HYL1）、Dicer like 1（DCL1）酶、鋅脂蛋白（SE）和核酸CAP結(jié)合復(fù)合體（CBC）的作用下，primiRNA被加工成具有特定二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體（premiRNA）；premiRNA在Hasty（HST）和其他蛋白因子的作用下被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在DCL1酶的酶切作用下形成成熟miRNA復(fù)合體（Mature RNA duplexes），隨后，在HEN1和HYL1等酶的作用下形成成熟的miRNA；成熟miRNA與Argonaute（AGO）蛋白相互作用形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物體（RNAinduced silencing complex，RISC），最后與靶基因結(jié)合行使其功能[3，4]。

2小麥miRNA研究進(jìn)展

2.1小麥miRNA的識(shí)別

植物miRNA的識(shí)別方法主要有直接克隆法、生物信息預(yù)測(cè)法和高通量測(cè)序法三種方法。直接克隆法是先建sRNA庫(kù)，再測(cè)序[5～7]。生物信息預(yù)測(cè)法是根據(jù)miRNA序列在物種間的保守性和miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特殊性搜索同源miRNA[7，8]。二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為miRNA的識(shí)別提供了平臺(tái)，高通量測(cè)序技術(shù)具有規(guī)模大和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前植物miRNA識(shí)別運(yùn)用最廣泛的一種技術(shù)。由于植物體內(nèi)有較多與miRNA相似的sRNA，在鑒定過(guò)程中容易與miRNA混淆。針對(duì)這一點(diǎn)，科學(xué)家們根據(jù)miRNA的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)置了辨別miRNA真?zhèn)蔚臉?biāo)準(zhǔn)[9～12]。

植物miRNA的保守性為小麥miRNA的識(shí)別提供了方便。2005 年，Zhang等對(duì)小麥 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，共獲得 16 條小麥 miRNA，分屬于9個(gè)miRNA家族[13]；Jin等利用基因組的支持向量機(jī)程序?qū)π←淓ST進(jìn)行分析，共得到79條候選miRNA[14]。小麥基因組測(cè)序及單條染色體的分離和測(cè)序，為小麥miRNA的識(shí)別提供了更多的資源。Lucas等在小麥1AL染色體上鑒定了42條保守miRNA[15]。2014年，Kurtoglu等利用小麥基因組Shortgun測(cè)序結(jié)果進(jìn)行已知miRNA的同源搜索，共得到52條miRNA[16]。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展加快了miRNA的識(shí)別速度。Yao等[17]和Wei等[18]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小麥sRNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，分別得到了58條和70條miRNA。Li等以小麥7天幼苗為材料，提取RNA進(jìn)行sRNA測(cè)序分析，共得到分屬于32個(gè)家族的miRNA，并用降解組測(cè)序方法驗(yàn)證了這些miRNA的53個(gè)靶基因[19]。Chen等對(duì)高產(chǎn)小麥Yunong 201及其突變體Yunong 3114分別進(jìn)行sRNA測(cè)序，分別獲得924條和1 325條miRNA[20]。

2.2小麥miRNA的時(shí)空表達(dá)特性

植物miRNA的時(shí)空表達(dá)特異性分析主要是運(yùn)用試驗(yàn)手段和高通量分析進(jìn)行的，其中，試驗(yàn)方法運(yùn)用較廣泛的是Northern blot和RTqPCR。Northern blot能夠根據(jù)特定miRNA設(shè)計(jì)探針，進(jìn)而針對(duì)植物不同組織或發(fā)育時(shí)期進(jìn)行miRNA的表達(dá)模式分析[21]，其缺點(diǎn)是靈敏度較低，很難檢測(cè)到低豐度的miRNA。RTqPCR以其高靈敏度、低成本和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于miRNA表達(dá)模式分析上[22， 23]。Han等以小麥為研究材料，對(duì)目前植物應(yīng)用最廣泛的莖環(huán)RTqPCR （stemloop RTqPCR）和加A RTqPCR （poly（A） RTqPCR） 方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，認(rèn)為poly（A） RTqPCR更適用于小麥miRNA研究[24]。高通量分析方法主要包括miRNA芯片和高通量測(cè)序。miRNA芯片可以對(duì)不同發(fā)育時(shí)期、生物和非生物脅迫條件下所有植物的miRNA進(jìn)行表達(dá)模式分析，但是，目前miRNA的探針有限，僅能檢測(cè)到已知miRNA。高通量測(cè)序不僅可以鑒定特定條件下的已知miRNA，還能夠同時(shí)檢測(cè)到新miRNA和低豐度miRNA，并將其表達(dá)量用reads數(shù)來(lái)表示，從而揭示其差異表達(dá)模式。

Yao和Xin等對(duì)鑒定得到的小麥miRNA進(jìn)行Northern blot表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR502在莖間、根和葉中高表達(dá)；miR507和miR509在根中高表達(dá)，在莖和莖間中表達(dá)量減少，在葉、旗葉和穗中表達(dá)量極低；miR513和miR514在根中高表達(dá)；miR515只在根和葉中表達(dá)；miR2003和miR2004在莖、穗和根中的表達(dá)量高于在葉中的表達(dá)；miR2001和miR2011在葉和根中表達(dá)量高于莖和穗[17， 25]。Meng等通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在小麥發(fā)育期的籽粒中得到605條保守miRNA和268條新miRNA，推測(cè)其中的 86條保守miRNA可能參與調(diào)控小麥籽粒的灌漿，18條新miRNA可能對(duì)小麥籽粒的成熟有重要作用[26]。Han等對(duì)小麥五葉期幼苗、孕穗期旗葉以及揚(yáng)花后5、10、20天的小麥籽粒進(jìn)行sRNA測(cè)序，共得到24條已知miRNA和55條新miRNA。時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，已知miRNA中的miR160、miR164、miR166和miR169在籽粒中的表達(dá)量高于其他組織/器官，miR156、miR172、miR168、miR396、miR159、miR398、miR1318、miR167在旗葉的表達(dá)量高于其他組織/器官；55條新miRNA中的22條在籽粒中表達(dá)量高于其他組織（其中有12條只在籽粒中表達(dá)），28條在旗葉的表達(dá)量高于其他組織/器官[27]。Li等以7、14、21、28天的中國(guó)春小麥籽粒為材料，通過(guò)sRNA和降解組測(cè)序共獲得186條保守miRNA和37條新miRNA。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中的55個(gè)miRNA家族在四個(gè)籽粒發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式不同，miR408和miR5048的表達(dá)量隨著籽粒的生長(zhǎng)而升高；miR319和miR827在籽粒發(fā)育前期表達(dá)量逐漸升高，在籽粒發(fā)育后期，其表達(dá)量又逐漸降低；miR169、miR165和miR444等隨著籽粒的生長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸降低[28]。

2.3小麥miRNA與逆境脅迫的關(guān)系

miRNA不但與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和花發(fā)育相關(guān)[29～31]，還與逆境脅迫相關(guān)[32]。部分miRNA的靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子，在植物中具有組織特異表達(dá)特性[30， 33]。Xin等分析了白粉菌侵染前后和熱脅迫前后小麥葉片中miRNA的豐度變化，在鑒定出的153條miRNA中分別有24條和12條miRNA的表達(dá)量在白粉病侵染前后、熱脅迫前后發(fā)生了明顯變化[25]。馮浩對(duì)苗期感病但成株期抗病的小麥品種興資9104進(jìn)行條銹菌接種，研究15條miRNA在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均能受條銹菌侵染的誘導(dǎo)，并呈現(xiàn)出多種表達(dá)趨勢(shì)，這表明興資9104的條銹病抗/感性狀并不是由某一條或者一類miRNA調(diào)控決定的，而是多條miRNA共同調(diào)控的結(jié)果[34]。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在生物脅迫和非生物脅迫下，miR393、miR167和miR160表達(dá)量均會(huì)出現(xiàn)變化[35]。Tang等發(fā)現(xiàn)miR167、miR393、miR172、miR396和miR444在小麥?zhǔn)艿嚼涿{迫后，其表達(dá)量也發(fā)生了明顯變化[36]。當(dāng)小麥?zhǔn)艿降蜏靥幚頃r(shí)，隨著溫度的降低，miR165、miR166和miR319的表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，但是，當(dāng)小麥在同時(shí)受到低溫和外源ABA脅迫時(shí)，miR165和miR166的表達(dá)量呈現(xiàn)降升降趨勢(shì)，miR319呈先降后升的趨勢(shì)，說(shuō)明ABA改變了這三條miRNA的表達(dá)模式[37]。

2.4小麥miRNA功能研究方法

在植物中，miRNA的功能主要是通過(guò)調(diào)節(jié)其靶mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的，調(diào)控方式與siRNA（Small interfering RNA）相似，即通過(guò)類似于RNA干擾的機(jī)制來(lái)切割或者是抑制靶基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7，30，38]。miRNA切割目標(biāo)mRNA是使與其互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域的某兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵發(fā)生斷裂[38]，鍵的斷裂主要是由具有核酸內(nèi)切酶活性的AGO1蛋白介導(dǎo)[39，40]。

植物miRNA還能在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)靶標(biāo)DNA的甲基化。Khraiwesh等對(duì)小立碗鮮DCLl基因缺失突變體中的miRNA和其靶mRNA豐度進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，靶mRNA并未發(fā)生切割，但其轉(zhuǎn)錄本水平卻大幅度降低，其原因是這些突變體積累的miRNA與靶標(biāo)形成miRNA：靶標(biāo)mRNA雙聯(lián)體，進(jìn)而使編碼靶mRNA的基因過(guò)度甲基化而發(fā)生沉默[41]。Wu等也報(bào)道了水稻中一類由DCL3切割產(chǎn)生的長(zhǎng)度為24 nt的新miRNA（long miRNA，簡(jiǎn)寫(xiě)為lmiRNA）。該項(xiàng)研究證實(shí)了lmiRNA可以依據(jù)其產(chǎn)生機(jī)制和5′末端核苷酸選擇結(jié)合AGO4蛋白，然后招募重新甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2甲基化其鄰近的靶基因，從而在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行基因的表達(dá)調(diào)控[42]。

2.4.1小麥miRNA功能研究方法基因功能的研究一般采用基因的過(guò)表達(dá)或者干擾（抑制、敲除）的方法進(jìn)行，miRNA的功能研究也不例外，但是，miRNA行使功能的只是21 bp長(zhǎng)度的成熟miRNA，不同于其它功能基因。利用轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)化miRNA的前體序列是研究其功能最常用的方法之一[43， 44]。借助病毒載體瞬時(shí)過(guò)表達(dá)miRNA是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)研究其功能的方法。Feng等用含有小麥miR159前體的大麥條斑花葉病毒（BSMV）侵染小麥，然后，利用Northern blot對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥體內(nèi)miR159含量明顯高于只接種BSMV的小麥植株，認(rèn)為miRNA表達(dá)量的增加是由病毒攜帶的miR159前體通過(guò)siRNA切割方式形成的[45]。韓冉利用同樣方法在小麥中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)了miR156，發(fā)現(xiàn)miR156的增加可導(dǎo)致小麥抽穗時(shí)間延遲[46]。

STTM（Short tandem target mimic）短串聯(lián)靶標(biāo)類似物，是人工合成的一段短的目標(biāo)重復(fù)序列，兩端為目標(biāo)miRNA結(jié)合位點(diǎn)。該序列能結(jié)合目標(biāo) miRNA，從而能有效阻止miRNA與目的基因的結(jié)合，導(dǎo)致目的基因的積累，是研究目標(biāo)miRNA功能的重要介質(zhì)[47～49]。目前，已有利用STTM技術(shù)研究小麥miRNA功能的報(bào)道。Jiao等將含有miR159和miR3134a的STTM分別連接到BSMV載體上，然后分別侵染小麥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR159和miR3134a的表達(dá)量較對(duì)照均明顯減少[50]。

2.4.2小麥miRNA功能研究由于小麥miRNA研究起步較晚，目前對(duì)其研究還處于鑒定、功能預(yù)測(cè)和功能相關(guān)性研究上。目前，小麥miRNA功能研究主要是通過(guò)對(duì)靶基因的功能預(yù)測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Yao等通過(guò)搜索小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，在232條小麥miRNA中共檢測(cè)得到189條靶基因，并指出在小麥和其它植物中保守的miRNA，其靶基因序列也比較保守，這些靶基因涉及到部分轉(zhuǎn)錄因子，其功能主要是調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和參與逆境脅迫；對(duì)于小麥特有的miRNA，其靶基因主要參與細(xì)胞代謝和生物非生物脅迫[51]。

3展望

綜上所述，雖然小麥miRNA研究起步較晚，miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的小麥miRNA數(shù)量較少，但是，近年來(lái)小麥miRNA的預(yù)測(cè)與鑒定研究進(jìn)展很快。目前，已鑒定出的小麥miRNA有1 500多條，miRNA功能研究方法也逐漸完善。相信隨著小麥全基因組組裝的完成以及生物信息學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，小麥 miRNA 的研究會(huì)更為全面和深入。

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