劉偉杰 張琳 許傳田 楊少華 黃艷艷 黃慶華 張秀美 吳家強(qiáng)

摘 要：為了明確硫代CpG ODN對CEF增殖能力的影響，將CpG ODN2006進(jìn)行硫代修飾，與CEF共孵育，測定了不同濃度和時間條件下細(xì)胞的增殖率。結(jié)果表明： CEF對硫代CpG ODN的耐受值為80 μg/mL；20 μg/mL硫代CpG ODN作用24～120 h，CEF均能夠增殖，且48～72 h增殖效果最為顯著。該結(jié)果為進(jìn)一步研究CpG ODN激發(fā)CEF免疫應(yīng)答效果和體外篩選體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CpG ODN；硫代修飾；CEF；增殖

中圖分類號：S852.5+2文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0108-03

Abstract In order to confirm the influence of phosphorthioate CpG ODN on proliferation of CEF， the cell proliferation rates were measured at different concentrations and times as CEF was treated with phosphorthioate CpG ODN2006. As a result， the tolerance value of CEF to phosphorthioate CpG ODN was 80 μg/mL. When incubated with phosphorthioate CpG ODN of 20 μg/mL for 24 to 120 hours， the CEF all was in proliferation condition， among which， the effect between 48 to 72 hours was significant. The results would provide a basis for further studies on CEF immune response stimulated by CpG ODN and the screening of CpG ODN in vitro.

Key words CpG ODN； Phosphorthioate； CEF； Proliferation

CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）是含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的核苷酸序列，能夠在機(jī)體內(nèi)誘生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[1]，配合常規(guī)和新型疫苗使用能顯著增強(qiáng)疫苗免疫效果，是目前新型免疫佐劑研究熱點之一[2]。CpG ODN的硫代修飾能夠增強(qiáng)對細(xì)胞的刺激效果[3]，防止水解酶的降解，但相關(guān)研究表明，硫代修飾會產(chǎn)生一定的非特異性細(xì)胞毒性作用，對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，超過一定濃度時細(xì)胞表現(xiàn)為免疫抑制[4，5]。因此，以細(xì)胞模型研究硫代CpG ODN功能時，首先要明確其對培養(yǎng)細(xì)胞增殖和存活能力的影響，篩選合適的工作濃度。

雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblast ， CEF）具有容易獲得、增殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、耐受性良好、性狀穩(wěn)定的特點，廣泛應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)的研究[6]。CEF與雞體的免疫應(yīng)答模式類似，能夠最大化模擬雞體的反應(yīng)，可作為研究動物機(jī)體反應(yīng)的起點[7]。為了建立利用CEF體外篩選雞特異性CpG ODN活性分子的體系，本研究將硫代CpG ODN與CEF共培養(yǎng)，明確其對CEF增殖能力的影響，為體外篩選體系的建立提供研究基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9日齡SPF雞胚購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心；CpG ODN選擇對雞有良好刺激效果的CpG ODN2006（5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3′），由上海生工合成，全鏈硫代修飾。

胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、MTT、DMSO購自Gibico；胰酶購自Sigma；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Coster；青鏈霉素雙抗購自TaKaRa。

1.2 試驗方法

1.2.1 CEF的制備 取9日齡SPF雞胚1枚，去掉胚體的頭、四肢、內(nèi)臟等，無血清DMEM培養(yǎng)液清洗后剪成碎塊，然后再次清洗并棄去洗滌液。加入胰酶進(jìn)行消化，待組織塊變松后加入含10%血清的DMEM反復(fù)吹打，使組織均勻。取上清經(jīng)100目細(xì)胞篩過濾，濾液即細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后加入細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 硫代CpG ODN濃度對CEF毒性的測定 將制備的CEF密度調(diào)整為5×106個/mL，加入96孔細(xì)胞板，每孔100 μL，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使CEF貼壁并生長成單層細(xì)胞。將硫代CpG ODN用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成不同濃度后加入不同細(xì)胞孔中，工作濃度分別為400、200、150、100、80、50、30、20、10、5、2.5 μg/mL，每個濃度重復(fù)6孔，每孔終體積200 μL，同時添加PBS替代硫代CpG ODN的陰性對照。輕輕混勻后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。在培養(yǎng)終止前4 h，每個細(xì)胞孔加入MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h，取出后棄上層營養(yǎng)液，按100 μL/孔加入DMSO，置于搖床上晃動10 min，使結(jié)晶紫完全溶解。然后酶標(biāo)儀上測定各孔OD570的值。各硫代CpG ODN濃度對CEF的毒性以細(xì)胞增殖率來衡量，其計算方法為：增殖率（%）=（OD試驗組-OD對照組）/OD對照組×100，以陰性對照值為參照，低于陰性對照值表示產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

1.2.3 硫代CpG ODN作用時間對CEF增殖能力的影響 根據(jù)不同濃度硫代CpG ODN作用下CEF增殖率的結(jié)果，選取最優(yōu)刺激濃度進(jìn)行作用時間對CEF增殖能力影響的確定。CEF鋪板后24 h，與硫代CpG ODN分別共培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，然后采用MTT法測定各時間段細(xì)胞OD570的值，通過計算增殖率來衡量CEF的增殖狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫代CpG ODN作用濃度對CEF增殖的影響

通過計算各濃度硫代CpG ODN作用下CEF的增殖率可知，隨著濃度的增大，增值率先上升后下降，當(dāng)濃度處于2.5～20 μg/mL之間時，對CEF刺激效果良好，增殖率持續(xù)上升，至20 μg/mL時達(dá)到最高值；當(dāng)濃度大于20 μg/mL時，增殖率呈下降趨勢，達(dá)到80 μg/mL時，細(xì)胞增殖率為3.32%；當(dāng)濃度增加至100 μg/mL時，增殖率為負(fù)數(shù)，表明在此濃度下CEF未增殖，表現(xiàn)出一定程度的細(xì)胞毒性作用，濃度繼續(xù)增大時，增殖率進(jìn)一步降低。結(jié)果顯示， CEF對硫代CpG ODN的耐受濃度為80 μg/mL（圖1）。

2.2 硫代CpG ODN作用時間對CEF增殖的影響

選取濃度為20 μg/mL的硫代CpG ODN與CEF共孵育，在24～120 h的時間段內(nèi)，CEF始終處于增殖狀態(tài)（圖2）。24 h增殖率較低，僅為6.72%，48 h和72 h時增殖效果上升明顯，分別達(dá)到33.67%和31.38%，培養(yǎng)至96 h時，細(xì)胞增殖率又下降至16.53%。結(jié)果表明，最佳刺激濃度的硫代CpG ODN未對CEF產(chǎn)生明顯毒性，但為了得到最佳刺激效果，最佳孵育時間為48 h，最長應(yīng)避免超過72 h。

3 結(jié)論與討論

CpG ODN的免疫刺激作用具有種屬特異性。已有研究表明，小鼠免疫細(xì)胞的最佳刺激基序為GACGTT，而人免疫細(xì)胞的最佳刺激基序為GTCGTT，雞的最佳刺激基序與人相同也是GTCGTT[8，9]。CpG ODN2006含有3個GTCGTT基序，能夠有效刺激淋巴細(xì)胞增殖，提高免疫應(yīng)答效果[10]。本研究選擇全硫代的CpG ODN2006作用于CEF，進(jìn)行CEF模型耐受濃度和時間的摸索，以便同雞淋巴細(xì)胞的相關(guān)試驗結(jié)果進(jìn)行比較，從而為建立以CEF替代淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外篩選雞特異性CpG ODN活性分子的體系提供依據(jù)。

天然的CpG ODN進(jìn)入體內(nèi)和細(xì)胞后極不穩(wěn)定，序列內(nèi)的磷酸二酯鍵是核酸水解酶的敏感位點，易受細(xì)胞內(nèi)和血清中核酸水解酶的降解，半衰期短（B型CpG ODN僅5 min左右）[11]，因此在人工合成時多將CpG ODN進(jìn)行部分或者全鏈的硫代修飾以防止序列的降解。然而，序列的硫代修飾往往會產(chǎn)生非特異性的細(xì)胞毒性作用，影響細(xì)胞存活率[4，5]，干擾試驗結(jié)果。前期研究結(jié)果表明，當(dāng)CpG ODN達(dá)到20 μg/mL（雞脾臟細(xì)胞濃度為5×106個/mL）時即出現(xiàn)細(xì)胞毒性抑制作用，極大限制了CpG ODN最優(yōu)工作濃度的篩選上限。而在本研究中，CEF在CpG ODN刺激濃度為80 μg/mL時依然呈現(xiàn)增殖狀態(tài)，表明在相同條件下CEF對細(xì)胞毒性的耐受閾值比淋巴細(xì)胞高出4倍，一定程度上避免了細(xì)胞毒性對試驗的干擾，同時使得CpG ODN的工作濃度篩選范圍更廣。

20 μg/mL的硫代CpG ODN對CEF的刺激效果最強(qiáng)，通過不同的作用時間發(fā)現(xiàn)，該濃度對細(xì)胞的刺激作用大于毒性作用而使細(xì)胞呈現(xiàn)增殖狀態(tài)，并未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。但各時間點細(xì)胞的增殖率差別明顯，48 h時最高，72 h略有降低，96 h時又下降至一半左右，24 h和120 h因刺激時間短和細(xì)胞死亡數(shù)增加而較低。所以，20 μg/mL硫代CpG ODN作用于CEF的各個時間點均能刺激細(xì)胞增殖，而最佳刺激時間在48～72 h。

本研究對CEF模型耐受硫代CpG ODN的濃度和時間進(jìn)行了測定，明確了刺激濃度和時間對細(xì)胞增殖能力的影響，為建立利用CEF體外篩選雞特異性CpG ODN活性分子的體系奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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