胡奇杰，朱佳茜，王新財，顧寬宇　(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江湖州 313000)

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鐵皮石斛飲片中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留檢測方法的研究

胡奇杰，朱佳茜，王新財，顧寬宇(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江湖州 313000)

摘要[目的]制定一套成熟的鐵皮石斛藥材中有機(jī)氯及擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留檢測方法。[方法]在空白鐵皮石斛中加入27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)品，用水浸潤樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式，用GC-μECD檢測農(nóng)藥殘留。[結(jié)果]試驗得出，建立的分析方法對各個農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。[結(jié)論]研究可為中藥材中農(nóng)藥的殘留檢測方法的制定和完善提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；有機(jī)氯及擬除蟲菊酯；凝膠凈化

農(nóng)藥多殘留(Pesticide Residues)是指使用農(nóng)藥之后一定時期內(nèi)沒有被分/降解而殘留于生物體內(nèi)、土壤、水體、大氣中的農(nóng)藥原體、降解物和有毒代謝物及雜質(zhì)的總稱。人們食用了被污染的中草藥后，殘留在其中的農(nóng)藥便會積聚在體內(nèi)，因其代謝緩慢，最終將導(dǎo)致急性或慢性中毒，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。因此世界各國對此高度重視，歐美等許多國家都對傳統(tǒng)藥和草藥制定了非常嚴(yán)格的農(nóng)藥多殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)藥多殘留檢測屬于復(fù)雜混合物中痕量組分分析技術(shù)，中藥材農(nóng)藥多殘留檢測具有以下特點：既需要精細(xì)的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測技術(shù)[1]。農(nóng)藥多殘留量檢測方法的研究已成為影響中藥國際貿(mào)易的最重要技術(shù)要求之一，嚴(yán)重制約了中藥發(fā)展的國際化與現(xiàn)代化。因此，研制簡單、快速、準(zhǔn)確，并可同時定性、定量的農(nóng)藥多殘留檢測方法是保障人民用藥安全，推動中藥材現(xiàn)代化建設(shè)迫切需要解決的問題之一。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。試驗采用的鐵皮石斛，采購自湖州仁皇山街道康龍保健食品商行。所用水為經(jīng)過二次蒸餾的重蒸水；丙酮、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，均為色譜純，默克公司；27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；無水硫酸鈉，分析純，麥克林。

1.1.2主要儀器設(shè)備。GC-μECD(Agilent7890B)；凝膠凈化系統(tǒng)GPC、全自動固相萃取儀，萊伯泰科(LAB TECH)公司；高速勻漿機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA；氮吹儀，美國Organomation；恒溫水浴振蕩器，上海精風(fēng)儀器有限公司；旋渦混勻器(IKAM S1)；高速冷凍離心機(jī)，貝克曼。

1.2方法

1.2.1樣品處理。提取：稱取2 g鐵皮石斛過篩粉末于均質(zhì)杯中，加入6 mL水，充分膨脹，然后加入10 mL丙酮和10 mL正己烷，15 000 r/min均質(zhì)1 min，離心，然后再用5 mL丙酮和10 mL正己烷均質(zhì)2次，合并上清液于加有10 mL飽和氯化鈉溶液的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置20 min，分層。

GPC凈化：吸取上層有機(jī)相過無水硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃管氮吹至近干，加6 mL乙酸乙酯+環(huán)己烷(1∶1)溶解。樣品過濾至GPC進(jìn)行凈化，收集9.5～17.5 min流出液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃管氮吹至近干，加入2 mL丙酮。

SPE凈化：預(yù)先用5 mL丙酮+二氯甲烷(1+1)活化Carb-NH2柱，加入待凈化液使其逐滴留下，用5 mL×2丙酮+二氯甲烷(1+1)洗脫，收集洗脫液氮吹至近干，加入2 mL正己烷。將弗羅里硅土柱依次用5 mL丙酮+正己烷(1+9)、5 mL正己烷預(yù)淋洗，加入上述待凈化，用5 mL×2丙酮+正己烷(1+9)洗脫，收集洗脫液氮氣吹至近干，用正己烷定容至1 mL。

1.2.2GC色譜條件。色譜柱：安捷倫DB-1701(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：320 ℃；柱溫程序升溫：150 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至270 ℃，保持23 min；柱流速：1 mL/min；不分流進(jìn)樣；載氣：氮氣，純度≥99.999%[2]。

2結(jié)果與分析

2.1提取過程加水的考察該試驗考察樣品在提取前加不加適量的水來考察提取效果，發(fā)現(xiàn)水浸潤后提取液澄清透明，因為加入適量的水能增加粉狀樣品之間的吸附力，經(jīng)過離心后能完全達(dá)到固液分離。不加水，提取后提取液渾濁，并且有粉末和纖維漂浮在上面，從而影響后續(xù)的試驗。并且加了水能使提取溶劑更好地浸入樣品中，從而有利于農(nóng)藥殘留的提取[3]。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，不加水各個農(nóng)藥回收率為38.2%～87.3%，而加水回收率提升到了78.6%～101.8%。因此，在有機(jī)溶劑提取樣品前應(yīng)先加入適量的水浸潤。

2.2提取溶劑的選擇樣品前處理的提取方法是影響到整個試驗成功的關(guān)鍵因素，選擇提取溶解有2個關(guān)鍵因素：第一是將痕量農(nóng)藥殘留完全從樣品中提取出來，第二是盡量少地溶解出雜質(zhì)。根據(jù)有機(jī)氯及擬除蟲菊酯的理化性質(zhì)和相似相溶原理，該試驗選擇乙腈、丙酮、正己烷、丙酮+正己烷4種提取溶劑考察提取效果。

通過試驗，發(fā)現(xiàn)除正己烷外其他3種溶劑提取能力相差不多，都能充分提取出農(nóng)藥殘留，但乙腈具有微毒性，并且沸點高，濃縮困難。丙酮雖然滲透性強(qiáng)，但是對于色素、黃酮、酯類等一些物質(zhì)也有很強(qiáng)的溶解性，在提取過程中也同時提取出大量的雜質(zhì)，不易凈化。因此，不考慮乙腈和丙酮作為單獨提取溶劑[4]。

正己烷雖然對于色素溶解性差，但是不能充分滲透到樣品內(nèi)部，且不能與水相溶，使得提取效率低，27種有機(jī)氯回收率在24.3%～58.1%，因此結(jié)合丙酮一起使用，既能充分地滲入樣品，也能相對較少地提取出其他的雜質(zhì)，在滿足提取效果的前提下，也為后續(xù)的凈化打下基礎(chǔ)。

2.3提取方式的選擇中藥材基質(zhì)復(fù)雜，提取難滲透，選用適宜的提取方法，能讓提取溶劑與鐵皮石斛基質(zhì)充分接觸、滲透。該試驗選用振蕩提取、超聲波提取和高速均漿提取3種方法考察，發(fā)現(xiàn)振蕩提取效果較差，超聲波提取其次，高速勻漿法提取效果最好(表1)。

樣品中加入的提取溶劑的量對于振蕩提取影響比較大。通過試驗發(fā)現(xiàn)，提取溶劑加入量越大，提取的回收率越高，但是隨著提取溶劑增加，回收率提升的幅度越來越小。加入少量的溶劑，在振蕩提取中不能充分與樣品內(nèi)部接觸，從而導(dǎo)致提取不充分，但是大量地增加溶劑會相應(yīng)地增加成本，并且振蕩提取的時間也相對比較長。

超聲波提取也是農(nóng)藥殘留常見的提取方法，但是在提取過程中，超聲波內(nèi)部水溫會隨著提取時間增長而升高，而部分農(nóng)藥殘留具有熱不穩(wěn)定性及揮發(fā)性，因此造成了部分農(nóng)藥殘留回收率低下。并且，在整個超聲容器中超聲波場的分布是不均勻的，類似在波場的分布中有死角，這會使得部分樣品的提取效率顯著下降，從而導(dǎo)致重現(xiàn)性較差。

使用高速均漿法能在較短時間內(nèi)，用較少的溶劑得到較好的回收率，并且重現(xiàn)性也較好。高速均漿是樣品在高速攪拌下從攪拌縫隙高速噴出，高壓高速情況下使得鐵皮石斛的粉末進(jìn)一步被破壞細(xì)化，從而使提取溶劑與鐵皮石斛粉末充分接觸，提高了提取效率，并且提取時間也進(jìn)一步縮短。

該試驗也考察了超聲波與振蕩聯(lián)用、超聲波與均漿聯(lián)用、振蕩與均質(zhì)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)超聲波與振蕩聯(lián)用回收率有了提高，但是還沒有達(dá)到試驗要求。后面兩者回收率與單獨使用均漿法相差不多，因此選用高速勻漿法作為該試驗的提取方法。

2.4GPC凈化條件的選擇凈化是利用農(nóng)藥殘留與基體干擾雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異，將雜質(zhì)含量減少到能正常檢測目標(biāo)農(nóng)藥的殘留水平。GPC可以根據(jù)化合物各個分子的大小來實現(xiàn)分離，分子越大通過凝膠色譜柱的速度越快。由于鐵皮石斛中含有大量的色素、多糖類大分子物質(zhì)，單純地用SPE不能完全除去樣品中的雜質(zhì)，因此可以用GPC來初步凈化提取的樣品，盡可能多地除去色素、多糖類雜質(zhì)[5]。

將濃度為0.5 μg/mL的27種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)注入GPC，以環(huán)己烷+乙酸乙酯(1+1)為流動相，流速為5 mL/min，通過紫外在線圖譜(圖1)，發(fā)現(xiàn)這些農(nóng)藥在9.5～17.5 min通過凝膠柱進(jìn)入檢測器。因此選擇9.5～17.5 min作為GPC凈化收集時間。

2.5SPE凈化柱的選擇通過GPC收集的流出液，發(fā)現(xiàn)還是有些顏色，說明有些色素等雜質(zhì)跟隨農(nóng)藥同時被洗脫收集。通過氣相色譜的檢測，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾目標(biāo)峰的現(xiàn)象還是比較嚴(yán)重，因此選擇固相萃取(SPE)來凈化收集液，SPE是目前農(nóng)藥殘留應(yīng)用中最廣泛、效果也是比較好的方法[6]。

該試驗選擇Carb-NH2柱、弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱(表2)，發(fā)現(xiàn)通過C18柱和氨基柱的凈化，樣品中還是有很多雜質(zhì)，使有些目標(biāo)農(nóng)殘被干擾或者覆蓋，可能這兩款柱子不能有效地吸附色素，從而不能達(dá)到理想的凈化效果。而Carb-NH2柱能有效去除樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素和糖類雜質(zhì)，弗羅里硅土柱能用于從非水溶液中吸附低極性以及中等極性化合物，有機(jī)氯及擬除蟲菊酯一般都是非極性或低極性的物質(zhì)，通過試驗發(fā)現(xiàn)，Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱除雜效果較好，但還是有一些干擾雜質(zhì)的存在。

通過Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱聯(lián)合使用，凈化效果非常理想。先通過Carb-NH2柱除去樣品中的色素、糖類及有機(jī)酸物質(zhì)，然后再用弗羅里硅土柱進(jìn)一步除去一些極性的雜質(zhì)，并且回收率也達(dá)到農(nóng)藥殘留的要求，因此選用雙柱聯(lián)用的凈化方式。

2.6前處理方法學(xué)考證樣品中加入分成3組的27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收、檢出限及重復(fù)性試驗[7]。3組有機(jī)氯及擬除蟲菊酯空白樣品加標(biāo)濃度為0.05 mg/kg的色譜圖見圖2。精密稱取鐵皮石斛樣品30份，各個農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.05 mg/kg和0.50 mg/kg 2個添加水平，重復(fù)試驗5次，通過GC-μECD檢測。試驗發(fā)現(xiàn)，各個農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測要求(表3)。

表2不同SPE對樣品的凈化效果及回收率

Table 2Effects of SPE on purification and recovery rate of sample

3結(jié)論

該試驗建立了27種有機(jī)氯及擬除蟲菊酯在中藥飲片鐵皮石斛中的GC-μECD的前處理方法：根據(jù)實驗室的實際條件，用水浸潤樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式。該方法既可有效提取鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留，又可完全去除雜質(zhì)干擾，簡便、省時、結(jié)果準(zhǔn)確。所建立的分析方法對各個農(nóng)藥的回收率在79.6%～103.1%，重復(fù)性在1.98%～8.26%，符合農(nóng)藥殘留檢測要求，可推廣應(yīng)用于中藥材中農(nóng)藥的殘留檢測。

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Detection Method of Organochlorine and Pyrethroid Pesticide Residue inDendrobiumofficinaleSlices

HU Qi-jie, ZHU Jia-xi, WANG Xin-cai et al

(Huzhou Institute for Food and Drug Control, Huzhou, Zhejiang 313000)

Key wordsDendrobiumofficinale; Organochlorine and pyrethroid; Gel purification

Abstract[Objective] To establish a mature detection method for organochlorine and pyrethroid pesticide residue inDendrobiumofficinaleslices. [Method] Standard substances of 27 organochlorines and pyrethroid were added intoD.officinale. After soaked in water, acetone and n-hexane were used as extraction solvent. With high-speed homogenate as the extraction means, GPC was combined with Florida silica and Carb-NH2column solid-phase extraction to purify the substances. [Result]GC-μECD detection found out that the recovery rate of each pesticide was 79.6%-103.1% with repeatability being 1.98%-8.26%, which met the requirements of the pesticide residue detection. [Conclusion] This research provides references for the establishment and improvement of pesticide residue detection method in Chinese Herbal Medicines.

基金項目浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2014C32088)。

作者簡介胡奇杰(1980- )，男，浙江湖州人，高級工程師，碩士，從事食品科學(xué)研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號S 481+.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-066-04