史守紀(jì)

草石蠶酶法制備低聚木糖及其抗氧化活性研究

史守紀(jì)

（無(wú)錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214153）

本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析法確定了草石蠶酶法制備低聚木糖的工藝條件，即pH為4，加酶量為379 mol/kg，酶解溫度為54℃，酶解時(shí)間為94 min，此條件下低聚木糖含量達(dá)到6.92 mg/mL，與3個(gè)對(duì)照組相比分別高了15.1%、11.4%、9.5%，差異顯著。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明，低聚木糖對(duì)羥自由基和超氧陰離子具有較強(qiáng)清除能力，因此，低聚木糖具有較好的抗氧化活性。

草石蠶；低聚木糖；抗氧化性

草石蠶含有豐富的纖維素和半纖維素，其中半纖維素的主要成分是木聚糖。木聚糖通過(guò)酶解法可制備低聚木糖，低聚木糖能夠促進(jìn)有益菌增殖（Courtin，2009；Hesta，2001）。除此之外，低聚木糖還有良好的耐酸和耐熱性，是預(yù)防齲齒的重要物質(zhì)成分。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，低聚木糖還有利于清除體內(nèi)自由基，有抗氧化功能（扶國(guó)才，2009；丁蘇，2008）。

目前，低聚木糖提取和生產(chǎn)方法較多，例如酸水解法、熱水抽提法、微波降解法和酶水解法。其中酶法制備主要原理是利用內(nèi)切型木聚糖酶定向酶解木聚糖，雜物較少，從而簡(jiǎn)化了后續(xù)低聚木糖的純化工藝（隋明，2011）。但在使用酶法制備過(guò)程中，要根據(jù)不同酶制劑類型選擇不同的工藝流程，因此進(jìn)一步研究采用不同類型酶制備低聚木糖的方法很有必要。本試驗(yàn)以草石蠶酶為原料，采用響應(yīng)面分析對(duì)草石蠶酶低聚木糖制備工藝進(jìn)行研究，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，以進(jìn)一步提高低聚木糖純化水平，進(jìn)而深入研究低聚木糖的抗氧化活性，為提高草石蠶酶資源利用效率、充分發(fā)揮低聚木糖抗氧化活性作用提供參考。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑草石蠶：廣東省農(nóng)科院提供；木聚糖酶、鄰苯三酚、NaOH等，購(gòu)買于廣州天馬試劑公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備FB45/7冷凍離心機(jī)（上海博迅公司）；AL204型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；UV-1900紫外分光光度計(jì)（美析儀器）；LZB型超聲粉碎儀（上海博迅公司）；HK-2A超級(jí)恒溫水?。牢鰞x器）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低聚木糖的酶解法制備工藝流程酶解底物→添加木聚糖酶→調(diào)pH值和溫度→酶解→木聚糖酶失活→離心→測(cè)定還原糖含量（朱浩擁，2011）。

1.3.2 還原糖含量測(cè)定還原糖含量測(cè)定采用DNS法（王憲澤，2002）。

1.3.3 羥自由基清除能力的測(cè)定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測(cè)定（Kawasaki，1995）。

1.3.4 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定（Xiao-ming，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 草石蠶酶法制備低聚木糖工藝優(yōu)化

2.1.1 不同pH對(duì)制備低聚木糖效果的影響選取2、3、4、5、6、7六個(gè)水平的pH，設(shè)定其他各因素條件不變，觀察草石蠶酶法制備低聚木糖的效果（呂曉晶，2010）。由圖1可以看出，pH為5時(shí)，草石蠶酶法制備低聚木糖的效果較好。

圖1 不同pH對(duì)制備低聚木糖效果的影響

2.1.2 不同加酶量對(duì)制備低聚木糖效果的影響選取100、200、300、400、500、600 U/g六個(gè)水平的加酶量，設(shè)定其他各因素條件不變，觀察草石蠶酶法制備低聚木糖的效果（王遠(yuǎn)，2009）。由圖2可以看出，加酶量為400 U/g時(shí)，草石蠶酶法制備低聚木糖的效果較好。

圖2 不同加酶量對(duì)制備低聚木糖效果的影響

2.1.3 不同酶解溫度對(duì)制備低聚木糖效果的影響選取35、40、45、50、55、60℃六個(gè)水平的酶解溫度，設(shè)定其他各因素條件不變，觀察草石蠶酶法制備低聚木糖的效果（丁勝華，2010）。由圖3可以看出，酶解溫度為50℃時(shí)，草石蠶酶法制備低聚木糖的效果較好。

2.1.4 不同酶解時(shí)間對(duì)制備低聚木糖效果的影響選取20、40、60、80、100、120 min六個(gè)水平的酶解時(shí)間，設(shè)定其他各因素條件不變，觀察草石蠶酶法制備低聚木糖的效果（李相前，2008）。由圖4可以看出，酶解時(shí)間為80 min時(shí)，草石蠶酶法制備低聚木糖的效果較好。

圖3 不同酶解溫度對(duì)制備低聚木糖效果的影響

圖4 不同酶解時(shí)間對(duì)制備低聚木糖效果的影響

2.2 響應(yīng)面分析法確定草石蠶酶法制備低聚木糖工藝條件

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 草石蠶酶法制備低聚木糖的試驗(yàn)因素和水平

分析草石蠶酶法制備低聚木糖的條件可知（表2），pH、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間這4個(gè)因素都是顯著因素。低聚木糖含量的二次回歸擬合方程如下：

低聚木糖含量/（mg/mL）=6.38-0.21A-0.42B+ 0.29C+0.33D-0.023AB-0.15AC-0.42AD-0.12BC-0.68BD-0.18CD-0.47A2-0.34B2-0.18C2-0.61D2。

從表3可知，草石蠶酶法制備低聚木糖的試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值＜0.0001，而且失擬項(xiàng)的P值是0.4623，說(shuō)明草石蠶酶法制備低聚木糖的試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛯?shí)際情況擬合度比較好，所以能對(duì)草石蠶酶法制備低聚木糖的條件進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化對(duì)草石蠶酶法制備低聚木糖的各因素交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，以低聚木糖含量為響應(yīng)值的曲面圖如圖5～10所示。

由圖5可以看出，pH與加酶量相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著。隨著pH的增大，低聚木糖含量先增后減，且變化幅度較大；隨著加酶量的增加，低聚木糖含量先增后減，變化幅度較小。

表2 草石蠶酶法制備低聚木糖的試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差

圖5 pH和加酶量相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

由圖6可以看出，pH與酶解溫度相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著。隨著pH與酶解溫度的增大，低聚木糖含量先增后減。

圖6 pH和酶解溫度相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

由圖7可以看出，pH與酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著，隨著pH與酶解時(shí)間的增大，低聚木糖含量先增后減。由圖8可以看出，加酶量與酶解溫度相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著。隨著加酶量與酶解溫度的增大，低聚木糖含量先增后減。

圖7 pH和酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

圖8 加酶量和酶解溫度相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

由圖9可以看出，加酶量與酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著，隨著加酶量與酶解時(shí)間的增大，低聚木糖含量先增后減。由圖10可以看出，酶解溫度與酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果影響顯著，隨著酶解溫度與酶解時(shí)間的增大，低聚木糖含量先增后減。

圖9 加酶量和酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

圖10 酶解溫度和酶解時(shí)間相互作用對(duì)制備低聚木糖效果的影響

由草石蠶酶法制備低聚木糖試驗(yàn)各因素曲面圖可看出，響應(yīng)值存在最大值。對(duì)草石蠶酶法制備低聚木糖的條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到草石蠶酶法制備低聚木糖的最佳條件為pH為4，加酶量為379 mol/kg，酶解溫度為54℃，酶解時(shí)間為94 min。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)依據(jù)表4進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以驗(yàn)證試驗(yàn)得到的草石蠶酶法制備低聚木糖的最佳條件為可靠。從表4看出，優(yōu)化組的低聚木糖含量最高，達(dá)到6.92 mg/mL，與3個(gè)對(duì)照組相比分別高了15.1%、11.4%、9.5%，且差異顯著。因此草石蠶酶法制備低聚木糖的最佳條件為pH為4，加酶量為379 mol/kg，酶解溫度為54℃，酶解時(shí)間為94 min。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.3 低聚木糖抗氧化性研究

2.3.1 羥自由基清除能力圖11顯示，低聚木糖對(duì)羥自由基的清除能力隨著其濃度的增加而不斷增強(qiáng)，低聚木糖濃度與羥自由基清除能力兩者之間基本呈線性相關(guān)，當(dāng)?shù)途勰咎菨舛葹?0 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率為87.2%，由此可以看出，低聚木糖對(duì)羥自由基的清除能力較強(qiáng)。

圖11 低聚木糖對(duì)羥自由基清除率的影響

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力圖12顯示，低聚木糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨著其濃度的增加而不斷增強(qiáng)，低聚木糖濃度與超氧陰離子自由基清除能力兩者之間基本呈線性相關(guān)，當(dāng)?shù)途勰咎菨舛葹?0 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率為89.6%，由此可以看出，低聚木糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

草石蠶酶法制備低聚木糖的最佳條件為pH為4，加酶量為379 mol/kg，酶解溫度為54℃，酶解時(shí)間為94 min，此條件下低聚木糖含量達(dá)到6.92 mg/mL，與3個(gè)對(duì)照組相比分別高了15.1%、11.4%、9.5%，且差異顯著。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，低聚木糖具有很強(qiáng)的抗氧化能力，但草石蠶中的低聚木糖結(jié)構(gòu)尚不確定，需要進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

圖12 低聚木糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響

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3.3 指標(biāo)的表觀回腸消化率和能量含量不同原料之間GE和DM的AID和ATTD有差異（P＜0.05）（表4）。DDC和CGnM中大部分干物質(zhì)分別為淀粉和蛋白質(zhì)，因此在所有原料中GE和DM的AID最大（P＜0.05）。4種DDGS原料和玉米皮中GE和DM的AID相似（P＞0.05）。

正如預(yù)期，DDC和CGnM中GE的ATTD最大（P＜0.05），分別是99.6%和91.6%。相比之下，CB-S和CB中GE和DM的ATTD最低，但兩個(gè)原料的AID值相似，說(shuō)明兩種原料均高度耐后腸發(fā)酵。DDGS，CGMM和CGnM中GE和DM的ATTD都與以前報(bào)道的結(jié)果一致（Rojas和Stein，

This test mainly studied the the preparation of xylo-oligosaccharide from Chinese artichoke and its antioxidant activity.The optimum condition of preparation of xylo-oligosaccharide from Chinese artichoke using enzymatic methods by response surface method were obtained，pH for 4，enzyme concentration for 379 mol/kg，enzymolysis temperature for 54℃，enzymolysis time for 94 min，and xylo-oligosaccharide content was 6.92 mg/mL at this condition，which was increased by 15.1%，15.1%，9.5%compared with the 3 control groups.And the experimental results showed that xylooligosaccharide had strong ability of scavenging hydroxyl free radical and superoxide anion free radical，so xylo-oligosaccharide had strong antioxidant activity.

Chinese artichoke；xylo-oligosaccharide；antioxidant activity

表4 各玉米副產(chǎn)物的表觀回腸消化率和表觀全腸道消化率

中國(guó)·豬營(yíng)養(yǎng)國(guó)際論壇

S816.7

A

1004-3314（2016）24-0022-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20162408