葛根總黃酮的提取及其降糖功效研究

方洪帥，王艷蕊，肖茜文，何　苗，王佳男，陳　萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春　130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春　130012）

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葛根總黃酮的提取及其降糖功效研究

方洪帥1，王艷蕊1，肖茜文1，何苗2，王佳男1，*陳萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省安信食品技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春130012）

摘要：采用乙醇回流法提取葛根總黃酮，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝為提取溫度70℃，提取時(shí)間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)80％，料液比1∶20。通過α-葡萄糖苷酶活性的抑制試驗(yàn)測(cè)定體外降糖性能，葛根總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率為66.7％。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，經(jīng)不同劑量組葛根總黃酮連續(xù)灌胃4周測(cè)定空腹血糖值和糖耐量，結(jié)果表明葛根總黃酮低、中、高劑量都可顯著（p＜0.05）降低糖尿病小鼠空腹血糖含量，降糖率分別為16.1％，25.6％，23.9％；各給藥組小鼠血糖值在0，0.5，1，2 h時(shí)均低于模型對(duì)照組小鼠，與模型對(duì)照組相比均能顯著（p＜0.05）抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，改善糖耐量。

關(guān)鍵詞：葛根；黃酮；提?。沪?葡萄糖苷酶抑制率；血糖

糖尿病是一種常見的代謝性疾病，是目前世界上威脅人類健康的幾大疾病之一。隨著人們生活質(zhì)量的提高和社會(huì)的發(fā)展，人類糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢(shì)[1-2]。研究表明，許多中草藥對(duì)調(diào)節(jié)血糖和防治糖尿病及其并發(fā)癥都有特殊的療效，從藥食同源植物中提取有效成分，研制具有降糖功效的食品有助于預(yù)防糖尿病的發(fā)生，也在解決人類糖尿病的問題上提供有效途徑。

葛根（Pueraria lobata）是一種藥食同源植物，具有很高的藥用價(jià)值，其中葛根總黃酮（Pueraria total flavoniods）是葛根最重要的活性物質(zhì)，多數(shù)研究側(cè)重其抗氧化活性。近年來(lái)，有關(guān)葛根總黃酮降血糖的研究也有一些報(bào)道。杜先鋒等人[3]分析得出，葛根中黃酮類含量高并且以葛根總黃酮為原料，配以南瓜、大豆蛋白，經(jīng)混合調(diào)配制成葛根降糖食品。本試驗(yàn)采用乙醇回流提取法從葛根中提取葛根總黃酮，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，開展葛根總黃酮、α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)，研究四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠空腹血糖及糖耐量的影響，探索其降糖規(guī)律，為葛根有效成分的利用以及促進(jìn)葛根降血糖產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料與試劑

葛根（Puerariae lobata），批號(hào)20150520，由吉林龍生科技公司生產(chǎn)；還原型谷胱苷肽，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；對(duì)硝基苯基-α- D -吡喃葡萄苷，上海藍(lán)季生物公司生產(chǎn)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，天津一方科技有限公司生產(chǎn)；四氧嘧啶，上海瑞永生物科技有限公司生產(chǎn)；阿卡波糖，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)；葡萄糖測(cè)定試劑盒（批號(hào)20150603147），上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2主要儀器

WD- 2102型自動(dòng)酶標(biāo)儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；N- 1001D- WA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；H- 2050R型離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；LGJ- 12型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1葛根總黃酮的提取及制備

精確稱取10 g葛根干粉，包成濾紙包，用體積比為1∶30的石油醚溫度于80℃下進(jìn)行脫脂回流，至虹吸管中溶液的顏色變?yōu)闊o(wú)色即為回流終點(diǎn)。取出濾紙包烘干，用乙醇溶液進(jìn)行提取、過濾、濃縮，用體積比為1∶1的正丁醇溶液萃取2次，分離出上層的有機(jī)相溶液進(jìn)行濃縮，加入100 mL的60％乙醇溶解，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏過夜，醇沉去多糖雜質(zhì)，過濾后濃縮至浸膏，冷凍干燥得葛根總黃酮[4-5]。

1.3.2葛根總黃酮提取量測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用60％乙醇溶解并定容至50 mL，得0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL容量瓶?jī)?nèi)；加入5％ 的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入10％ 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min；加入4％的NaOH溶液4 mL，搖勻；加入60％乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。在508 nm的波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度。以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為A=1.454 3X+0.006 7，R2=0.998 0.

（2）葛根總黃酮提取量的計(jì)算。將葛根總黃酮提取液用60％乙醇定容至100 mL，精密吸取1 mL，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線制定中的操作方法進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)定OD 值A(chǔ)，葛根總黃酮提取量Y（mg/g）計(jì)算公式為：

式中：Y——葛根總黃酮提取量，mg/g；

x——反應(yīng)樣品質(zhì)量，mg；

N——定容的體積與反應(yīng)樣液體積之比；

m——稱取的葛根質(zhì)量，g。

1.3.3葛根總黃酮提取的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。在其他條件相同的條件下，分別考察提取溫度50，60，70，80，90℃，提取時(shí)間1，1.5，2，2.5，3 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50％，60％，70％，80％，90％，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，4個(gè)單因素對(duì)葛根總黃酮提取量的影響。

（2）正交試驗(yàn)。以葛根總黃酮提取量作為試驗(yàn)的衡量指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比4個(gè)因素對(duì)葛根總黃酮提取量的影響，確定最佳提取工藝條件。

正交因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交因素與水平設(shè)計(jì)

1.4葛根總黃酮體外降糖功效測(cè)定

（1）設(shè)計(jì)反應(yīng)體系。67 mmol/L PBS緩沖液870 μL（pH值6.8），1 mg/mL谷胱甘肽溶液25 μL，1 mg/mL α-葡萄糖苷酶溶液35 μL，樣品100 μL，37℃水浴反應(yīng)10 min加入1 mmol/L PNPG 70 μL，37℃水溶反應(yīng)15 min，然后加入4 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于400 nm處測(cè)吸光度[6-7]。

（2）樣品對(duì)照組用等量的PBS緩沖液替代酶液。酶組用等量的PBS緩沖液替代樣品液；空白組用等量的PBS緩沖液替代酶液和樣品液；以上4組的其他操作均與樣品組相同。α-葡萄糖苷酶抑制率（％）計(jì)算公式為：

式中：A1——樣品組吸光度；

A2——樣品對(duì)照組吸光度；

A3——酶組吸光度；

A4——空白組吸光度。

1.5葛根總黃酮對(duì)四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖功效測(cè)定

1.5.1四氧嘧啶型糖尿病小鼠的建立

選取18～22 g健康的昆明種小鼠100只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，禁食（不禁水）12 h，給予腹腔注射四氧嘧啶生理鹽水溶液（200 mg/kg）。正常飼養(yǎng)3 d后再禁食12 h，自由飲水。眼眶靜脈取血，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，測(cè)定小鼠的空腹血糖值。選用空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L并有多飲、多食、多尿的小鼠作為建模成功小鼠[8-9]。

1.5.2動(dòng)物分組及給藥

選取空腹血糖值在11.1～26.1 mmol/L的小鼠60只，每組12只（雌雄各半），隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和葛根總黃酮高、中、低劑量組。陽(yáng)性對(duì)照組給予阿卡波糖80 mg/kg，葛根總黃酮組320，160，80 mg/kg，灌胃體積均為10 mL/kg。另取12只健康小鼠（雌雄各半）為正常對(duì)照組，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組灌服同體積的生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)4周。分別于第0周、第1周、第2周、第3周、第4周灌胃2 h后（禁食12 h），對(duì)各組小鼠眼眶取血測(cè)血糖值。

第15天禁食5 h，給藥，15 min后灌胃20％葡萄糖溶液（10 mL/kg體質(zhì)量），眼眶靜脈取血，分別測(cè)定給予葡萄糖后0，0.5，1，2 h的血糖值，進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)，計(jì)算血糖曲線下面積。血糖曲線下面積= 0.25×（0 h血糖值+ 4×0.5 h血糖值+ 3×2 h血糖值）。

1.5.3指標(biāo)測(cè)定

空腹血糖值、糖耐量的測(cè)定均參照文獻(xiàn)[10]，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用PASW Statistics18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均采用單因素Anova方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s，n=12）表示。

2結(jié)果與分析

2.1葛根總黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溫度對(duì)葛根總黃酮提取量的影響

提取溫度對(duì)提取量的影響見圖1。

圖1　提取溫度對(duì)提取量的影響

由圖1可以看出，提取溫度為50～70℃時(shí)，隨著提取溫度的上升，提取量增加；而提取溫度超過80℃后，提取量有所下降，并且提取液顏色加深明顯。可能由于提取溫度過高，使葛根總黃酮分解，或者提取溫度過高使葛根粉中淀粉、糖類糊化焦糖化，使體系黏度增加，不利于葛根總黃酮的提取。因此，所選提取溫度為70℃。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮提取量的影響

提取時(shí)間對(duì)提取量的影響見圖2。

圖2　提取時(shí)間對(duì)提取量的影響

由圖2可以看出，提取時(shí)間為1～2 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加提取量逐漸增加；但超過2 h后，提取量增加緩慢?？紤]節(jié)約能源和費(fèi)用，縮短提取周期和提高設(shè)備利用率，選取的提取時(shí)間為2 h。

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根總黃酮提取量的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響見圖3。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響

由圖3可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％～80％時(shí)，提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；而超過80％后，提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而下降；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％時(shí)，提取量達(dá)到最大值。因此，選定的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80％。

2.1.4料液比對(duì)葛根總黃酮提取量的影響

料液比對(duì)提取量的影響見圖4。

圖4　料液比對(duì)提取量的影響

由圖4可以看出，隨料液比的增加，葛根總黃酮的提取量呈上升趨勢(shì)。綜合考慮提取成本，采用料液比1∶20進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與最佳組合的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表2。

由表2可以看出，A，B，C，D這4個(gè)因素中，極差從大到小依次為C，A，B，D，極差越大則該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大，表明4個(gè)因素對(duì)葛根總黃酮提取量的影響依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。而最適的提取條件為A2B3C2D2，即提取溫度70℃，提取時(shí)間2.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)80％，料液比1∶20。在此組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)3次，取平均值得出葛根總黃酮提取量為18.2 mg/g。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

2.3葛根總黃酮體外降糖功效測(cè)定

葛根總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率見圖5。

圖5　葛根總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

按照1.4方法測(cè)定葛根總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。由圖5可以看出，隨著葛根總黃酮質(zhì)量濃度的增大，葛根總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率也增大；質(zhì)量濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí)抑制率增長(zhǎng)緩慢，達(dá)到了最大值66.7％，表明在8 mg/mL時(shí)葛根總黃酮與α-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)的結(jié)合達(dá)到飽和，因此則葛根總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的最適質(zhì)量濃度為8 mg/mL。葛根總黃酮具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

2.4葛根總黃酮對(duì)四氧嘧啶型糖尿病小鼠的降血糖研究

2.4.1葛根總黃酮對(duì)四氧嘧啶型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響

表3　葛根總黃酮對(duì)糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響（±s，n=12）

表3　葛根總黃酮對(duì)糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影響（±s，n=12）

組別空腹血糖值/ mmol·L-1第0周　　第1周　　第2周　　第3周　　第4周正常對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組葛根總黃酮低劑量組葛根總黃酮中劑量組葛根總黃酮高劑量組6.19±0.23 21.79±0.49 14.21±0.45ab15.74±0.49abc14.62±0.40ab14.70±0.31ab注：a與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；b與模型對(duì)照組相比，p＜0.05；c與陽(yáng)性對(duì)照組相比，p＜0.05 5.80±0.21 20.27±0.90 20.66±0.60a18.75±1.15a19.65±1.14a19.31±0.46a6.26±0.51 21.95±0.49 18.31±0.64ab18.92±0.60ab18.39±0.40ab18.74±0.62ab5.99±0.66 21.82±1.40 17.14±0.28ab17.80±0.11abc17.08±0.34ab17.56±0.29ab6.12±0.32 21.39±1.06 16.13±0.34ab17.12±0.78abc15.52±0.56ab16.08±0.98ab

由表3可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組和葛根總黃酮組小鼠與模型對(duì)照組相比，血糖從第1周開始顯著下降（p＜0.05），之后持續(xù)降低，說(shuō)明葛根總黃酮和阿卡波糖不僅具有降低血糖的作用，這種降血糖作用還具有一定的持續(xù)性。至第4周葛根總黃酮高、中、低劑量組小鼠和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的降糖率分別為16.1％，25.6％，23.9％，31.2％，葛根總黃酮高、中劑量組的降血糖效果與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異不顯著。

2.2.2葛根總黃酮對(duì)糖尿病模型小鼠糖耐量的影響

表4　葛根總黃酮對(duì)糖尿病模型糖耐量的影響（±s，n=12）

表4　葛根總黃酮對(duì)糖尿病模型糖耐量的影響（±s，n=12）

組別　0 h　7 h　14 h　21 h正常對(duì)照組模型對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組葛根總黃酮低劑量組葛根總黃酮中劑量組葛根總黃酮高劑量組血糖值　/ mmol·L-1血糖曲線下面積/ mm215.48±1.26 50.37±1.82a37.63±2.02ab42.07±1.23ab39.50±2.41ab40.54±1.08ab注：a與正常對(duì)照組相比，p＜0.05；b與模型對(duì)照組相比，p＜0.05 6.12±0.32 21.30±0.91a17.04±0.11a17.69±0.36a17.02±0.24a17.42±0.19a8.65±1.58 27.19±1.71a20.35±1.06ab22.19±1.60ab20.81±2.52ab21.42±1.73ab7.65±1.28 25.19±1.71a19.35±0.96ab21.49±1.20ab19.61±2.12ab20.38±1.33ab7.05±0.58 23.81±0.64a17.36±0.21ab20.61±0.67ab19.25±0.56ab19.69±0.30ab

由表4可以看出，給予不同葛根總黃酮?jiǎng)┝考鞍⒖úㄌ堑男∈笱侵翟?，0.5，1，2 h時(shí)均低于模型對(duì)照組小鼠，各給藥小鼠的血糖曲線下面積均明顯低于模型對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)表現(xiàn)為差異顯著（p＜0.05）。這表明葛根總黃酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，其中尤以葛根總黃酮中劑量組對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的改善最為明顯。

3　結(jié)論

采用乙醇回流法提取得到葛根總黃酮，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定，此法可行，較鉛沉淀提取法、滲濾法、酶解法，不需要特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)單、安全環(huán)保，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的降血糖機(jī)理主要為2個(gè)方面，一個(gè)是對(duì)降糖代謝過程中α-葡萄糖苷酶活性的調(diào)節(jié)作用，另一個(gè)是對(duì)激素水平的調(diào)節(jié)作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶活性增加，這些改變可能是糖尿病小鼠多飲多食、攝入過量的碳水化合物、誘導(dǎo)小腸黏膜消化吸收適應(yīng)性改變?cè)斐?。已有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠小腸葡萄糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)適應(yīng)性增強(qiáng)[12]。優(yōu)選出更好的α-葡萄糖苷酶抑制劑，已成為治療糖尿病的有效途徑。通過α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)，并且測(cè)定糖尿病小鼠空腹血糖值和糖耐量，評(píng)價(jià)葛根總黃酮不同劑量組的降糖效果，從而分析其降糖規(guī)律[13]。研究表明，葛根總黃酮質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，不同劑量組均能有效降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，中劑量組效果接近陽(yáng)性藥物阿卡波糖，與苗明三等人[8]研究結(jié)果基本一致。葛根總黃酮能抑制糖尿病小鼠餐后血糖的升高，明顯降低糖尿病小鼠血糖曲線下面積，顯著增強(qiáng)糖尿病小鼠葡萄糖的負(fù)荷糖耐量，可以通過抑制小腸中α-葡萄糖苷酶的活性，降低葡萄糖的吸收，從而降低血糖含量。但有關(guān)葛根總黃酮其他降血糖機(jī)理還需進(jìn)一步研究探討。

葛根總黃酮能有效持續(xù)地降低糖尿病小鼠的空腹血糖值、增強(qiáng)機(jī)體的糖耐量、改善糖尿病的發(fā)展，因此研究葛根降血糖以及治療人類糖尿病功能性食品的開發(fā)具有良好的理論參考和應(yīng)用價(jià)值。

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Extraction Technology of Puerariae Total Flavonoids and Hypoglycemic Effect

FANG Hongshuai1，WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，HE Miao2，WANG Jia'nan1，*CHEN Ping1
（1. College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2. Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

Abstract：Ethanol reflux method，orthogonal test are used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Pueraria. The optimum extraction of Pueraria total flavonoids：extraction temperature 70℃，extraction time 2.5 h，80％ ethanol concentration，material liquid than 1∶20. Hypoglycemic lowering effect is measured in vitro by the inhibitory to the activity of α- Glucosidase. The inhibition rate of Pueraria total flavonoids on the activity of α- Glucosidase is 66.7％，alloxan diabetic mice as model treated with different dose Pueraria total flavonoids for 4 weeks，then determining the blood glucose values and tolerance. The results of the low，medium and high doses total flavonoids of Pueraria all can be significantly（p＜0.05）reduced fasting blood glucose levels in diabetic mice，hypoglycemic rate respectively 16.1％，25.6％，23.9％，each treatment group blood glucose level of diabetic mice in 0，0.5，1，2 h are lower than the model group，they can inhibit the increase of postprandial hyperglycemia in diabetic mice compared to the model group，improveing glucose tolerance，the difference is significant（p＜0.05）.

Key words：Puerariae lobata；flavone；extraction；α- Glucosidase inhibitory rate；blood glucose

*通訊作者：陳萍（1968—），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

作者簡(jiǎn)介：方洪帥（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

收稿日期：2016- 01- 12

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）03a- 0006- 05

中圖分類號(hào)：Q503

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.002