苯胺降解菌群的馴化及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張　淼，崔岱宗，張　昊，趙　敏

（東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱　150040）

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苯胺降解菌群的馴化及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張淼，崔岱宗，張昊，*趙敏

（東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：通過對長期受苯胺污染的土壤進行定向馴化，篩選出能夠降解苯胺的高效菌群。經(jīng)16S rDNA基因擴增測序?qū)Ω咝Ы到獗桨返幕旌暇哼M行鑒定，初步鑒定該混合菌群分別為Serratia marcescens屬、Bacillus屬、Escherichia coli.屬、Leclercia tamura屬。通過單因素變量法對苯胺選擇性培養(yǎng)基進行優(yōu)化，研究表明該混合菌群最適碳源為可溶性淀粉，其最佳質(zhì)量濃度為2 g/L；最適氮源為氯化銨，其最佳質(zhì)量濃度為1 g/L；菌群最佳接種量為4％。優(yōu)化后的苯胺降解率為95％，較未優(yōu)化前提高了76.4％，對今后探究高效降解苯胺的方法具有重要的應用價值。

關鍵詞：苯胺降解；菌株鑒定；培養(yǎng)基的優(yōu)化

苯胺是指苯環(huán)上的1個氫原子被氨基取代而生成的化合物，廣泛應用于染料、農(nóng)藥和醫(yī)藥等領域[1]。隨著硝基苯催化氫法的誕生，苯胺產(chǎn)量迅速提高。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年苯胺產(chǎn)量已高達萬噸[2]。在生產(chǎn)和使用過程中，部分苯胺未經(jīng)處理即排放到環(huán)境中[3]。這類物質(zhì)化學性質(zhì)穩(wěn)定、難于降解，且具有致癌、致畸、致突變性，嚴重影響著賴以生存的環(huán)境及人類健康。因此，苯胺的無害化處理迫在眉睫[4]。目前，國內(nèi)外研究者探索了大量處理苯胺廢水的方法，主要包括物理化學法和生物法。其中，物理法主要包括吸附、萃取和超聲波降解；化學法則主要利用氧化及電氧化技術(shù)[5-7]。較物理化學法、生物法反應條件溫和，造價低廉，無明顯的二次污染，因此采用生物法降解苯胺受到了廣泛關注。

近年來，研究者已分離出多株可降解苯胺的菌群，它們分別屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、從毛單胞菌屬（Comamonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）、弗拉托菌屬（Frateuria）、莫拉克斯氏菌屬（Moraxella）和諾卡氏菌屬（Nocardia）[1，8-13]。篩選出的菌株降解苯胺的能力各不相同，在降解的過程中有時會出現(xiàn)初級階段降解速率快、后階段降解不理想的狀態(tài)，或者是初級階段降解速率慢、后階段降解速率快的現(xiàn)象，這說明現(xiàn)有的技術(shù)仍存在不穩(wěn)定因素[14]。因此，構(gòu)建一個高效且穩(wěn)定降解苯胺的菌株是解決生物降解苯胺的重要途徑之一。

研究中，筆者從長期受苯胺污染的土壤中馴化并分離出對苯胺具有較強降解能力的菌群。通過16S rDNA序列分析技術(shù)對該混合菌群進行鑒定分析，確定混合菌群中所含有的菌株類型及其屬性，并在此基礎上優(yōu)化了降解培養(yǎng)條件。

1材料與方法

1.1材料

研究中的環(huán)境樣品取自于吉林省吉林市某染料廠附近的土壤。

1.2苯胺降解菌株的篩選

稱取采集的土樣約2 g，放入裝有50 mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，加入6～8顆玻璃珠子。將錐形瓶置于37℃的培養(yǎng)箱中，以120 r/min轉(zhuǎn)速振蕩3 h，保證土壤與滅菌蒸餾水充分地混合。振蕩結(jié)束后，將懸濁液靜止放置1 h，使顆粒物質(zhì)沉淀，收取上清液，即為接種的環(huán)境樣品。

在超凈實驗臺中，將50 mL滅菌處理的LB液體培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，然后分別接種1 mL處理過的土壤上清液。置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。采用相同的方法，接種第1代富集菌群的菌液1 mL于新鮮的滅菌LB液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)，使樣品中的菌群可以得到富集和活化。

分裝苯胺（100 mg/L）篩選培養(yǎng)基50 mL于錐形瓶中，接種第2次活化菌液1 mL，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱過夜進行篩選培養(yǎng)，測量其降解率。采用相同的方法，逐步提高篩選培養(yǎng)基中苯胺的質(zhì)量濃度至1 000 mg/L，觀察苯胺的降解效果，初步得到一個相對穩(wěn)定的降解苯胺菌群。

將篩選后的混合菌群在LB固體篩選培養(yǎng)基（苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）中進行梯度稀釋劃線分離，且對長出的單一菌落進行劃線純培養(yǎng)。

保存選出的降解菌株，用甘油作為保護劑，置于- 40℃冰箱保存。

1.3降解菌株的鑒定

采用16S rDNA序列分析的方法對分離的好氧苯胺降解菌進行鑒定，菌株基因組DNA的提取方法按本研究組之前所描述的方法進行。以提取的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F：5'- GAGTTTG ATCMTGGCTCAG- 3'；1492R：5'- TACGGYTACCTTA CGACTT- 3'，對細菌的16S rDNA序列進行擴增。PCR反應條件如下：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃保溫10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳（120 V）檢測，并用凝膠成像掃描系統(tǒng)照相分析。將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD 18- T質(zhì)粒，過夜后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)中，挑取確定為陽性克隆的菌液送到測序公司進行測序。采用Contig Express軟件對所測得的序列進行拼接，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，下載相關序列，確定所獲菌群的菌屬。

1.4菌體對苯胺降解曲線的測定

將保存的菌種按接種量2％接種于LB液體培養(yǎng)基中，使菌體活化。

將活化后的菌群按接種量2％接種于苯胺篩選培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h取樣1次。

將取出的菌體樣品，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心3 min。取上清液，做苯胺降解率的測定。

苯胺降解率的測定方法：在2.5 mL體系中，加入20 μL樣品上清液，980 μL蒸餾水，8 μL KHSO4，調(diào)節(jié)pH值在1.5～2.0時，加入5 μL 5％的NaNO2，搖勻后靜置3 min，再加入氨基磺酸銨50 μL，振蕩后靜置3 min，最后加入2％的N - 1 -萘基-乙二胺鹽酸鹽100 μL，加水稀釋至2.5 mL，放置10 min，于紫外分光光度545 nm處測定吸光度（以蒸餾水做空白對照），并與標準質(zhì)量濃度苯胺吸光度進行對比，進而求出降解率；每個樣品做1個平行對照。

1.5培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.5.1最適碳源的測定

將50 mL碳源分別為葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油的篩選培養(yǎng)基（苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）裝入滅菌的錐形瓶中，將活化后的菌群按接種量2％分別加入各錐形瓶。每種碳源設置2個平行試驗，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，振蕩培養(yǎng)20 h后，取出3 mL菌液，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液，按照上述苯胺降解率的測定方法處理后，于545 nm處測定苯胺的剩余吸光度，計算苯胺的降解率。

1.5.2最適碳源添加量的測定

將50 mL碳源（可溶性淀粉）質(zhì)量濃度分別為2，4，6，8，10，12 g/L的篩選培養(yǎng)基（苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）裝入錐形瓶中，后續(xù)操作方法同1.5.1。

1.5.3最適氮源的測定

將50 mL氮源分別為氯化銨、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、純蛋白胨和酵母提取液的篩選培養(yǎng)基（苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）裝入錐形瓶，后續(xù)操作方法同1.5.1。

1.5.4最適氮源添加量的測定

將50 mL氮源（氯化銨）質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5，6 g/L的篩選培養(yǎng)基（苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L）裝入錐形瓶中，后續(xù)操作方法同1.5.1。1.5.5最適接種量的測定

將50 mL質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的苯胺篩選培養(yǎng)基裝入錐形瓶中，把已經(jīng)活化的菌株按照1％，2％，3％，4％，5％，6％的接種量分別接種到各錐形瓶中。后續(xù)操作方法同1.5.1。

2結(jié)果與分析

2.1混合菌群中純菌株的篩選

采用不斷提高培養(yǎng)基中苯胺質(zhì)量濃度的方法對土壤樣品菌群進行馴化，最終得到可以穩(wěn)定降解苯胺的混合菌群，并對該混合菌群進行劃線分離，從而獲得18個純菌株。

2.2純菌鑒定結(jié)果

純菌株DNA基因組電泳見圖1，16S rDNA的PCR擴增結(jié)果見圖2。

圖1　純菌株DNA基因組電泳

圖2　16S rDNA的PCR擴增結(jié)果

測序結(jié)果表明，純菌株擴增出的16S rDNA片段大小從1 504～1 514 bp不等，經(jīng)Gen Bank數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)其與沙雷氏菌（Serratia marcescens）、芽孢桿菌（Bacillus）、大腸桿菌（Escherichia coli.）、勒克氏菌（Leclercia tamura）同源性最高，相似度均高達99％以上。目前，已有報道表明芽孢桿菌屬有降解苯胺及其派生物的能力。

2.3苯胺降解曲線的測定

苯胺降解率見圖3。

圖3　苯胺降解率

由圖3可知，混合菌群在苯胺質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的降解培養(yǎng)基中，前15 h降解效果不明顯；從15 h開始，降解率有了明顯上升；25～29 h時，降解效率提高較快；31 h時，降解率達頂峰，降解效果比較穩(wěn)定。推測最初的15 h內(nèi)混合菌群處于延滯期，生長緩慢，對苯胺的降解率很低；從15 h開始，菌群進入對數(shù)生長期，菌群生長量明顯增加，對苯胺的降解率最快，其降解率高達95％；31 h后菌體生長處于穩(wěn)定期，對苯胺的降解能力達到平穩(wěn)狀態(tài)。

2.4降解條件的優(yōu)化

2.4.1最適碳源的測定

分別測定了以葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油作為碳源時，混合菌株在培養(yǎng)基中對苯胺的降解情況。

不同碳源對苯胺降解的影響見圖4。

圖4　不同碳源對苯胺降解的影響

由圖4可知，混合菌株對苯胺降解的最適碳源為可溶性淀粉，在此碳源下約81.3％的苯胺在20 h內(nèi)被降解，遠遠高于在其他碳源篩選培養(yǎng)基中的降解率。當以蔗糖、果糖、乳糖、甘油分別作為碳源時，混合菌群對苯胺均能進行降解，但降解效果并不明顯，說明這些碳源不能被該菌群充分利用。

2.4.2最適碳源添加量的測定

測定了可溶性淀粉的質(zhì)量濃度為2，4，6，8，10，12 g/L時，混合菌株對苯胺的降解情況。

不同碳源添加量對苯胺降解的影響見圖5。

圖5　不同碳源添加量對苯胺降解的影響

由圖5可知，在前5組添加量條件下，混合菌群對苯胺的降解率均高于70％，說明可溶性淀粉的質(zhì)量濃度對苯胺的降解效果并沒有明顯差異。其中，當可溶性淀粉的質(zhì)量濃度分別為2 g/L和10 g/L時，降解率均已高于80％，但考慮成本，選擇質(zhì)量濃度為2 g/L的可溶性淀粉作為最適質(zhì)量濃度。當可溶性淀粉質(zhì)量濃度為12 g/L時，對苯胺的降解率降至為42％，推測該質(zhì)量濃度抑制菌群對苯胺的降解能力。

2.4.3最適氮源的測定

研究中測定了在不同氮源的條件下，混合菌群對苯胺降解的效率。氮源分別為氯化銨、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、純蛋白胨和酵母提取液。

不同氮源對苯胺降解的影響見圖6。

圖6　不同氮源對苯胺降解的影響

由圖6可知，氯化銨、硫酸銨和硝酸銨分別作為氮源時，混合菌株對苯胺的降解率均超過了80％，說明NH4+作為氮源時，混合菌群對苯胺降解率均很高。其中，氯化銨作為氮源時，苯胺的降解率為91％，對苯胺的降解效果最佳；但當純蛋白胨和酵母提取液作為氮源時，混合菌群對苯胺的降解效果不很明顯，較其他氮源顯著下降，這可能是因為有機氮源結(jié)構(gòu)復雜不易被利用。

2.4.4氮源添加量的測定

研究中已確定氯化銨為最佳氮源，因而繼續(xù)探討不同氮源質(zhì)量濃度對苯胺降解的影響。氯化銨質(zhì)量濃度分別為1，2，3，4，5，6 g/L。

不同氮源添加量對苯胺降解的影響見圖7。

圖7　不同氮源添加量對苯胺降解的影響

由圖7可知，混合菌株在氯化銨質(zhì)量濃度從1 g/L 到6 g/L對苯胺的降解效果無明顯差異，均達到86％以上。其中，當氯化銨質(zhì)量濃度為1 g/L時，混合菌群對苯胺的降解率略高于其他氯化銨質(zhì)量濃度對苯胺的降解率，為91％。因此，選擇質(zhì)量濃度為1 g/L的氯化銨作為氮源。

2.4.5最適接種量的測定

研究中通過改變混合菌群的接種量，觀察混合菌群對苯胺降解效果的影響?；旌暇旱慕臃N量分別為1％，2％，3％，4％，5％，6％。

混合菌群接種量對苯胺降解的影響見圖8。

圖8　混合菌群接種量對苯胺降解的影響

由圖8可知，接種量由1％增加到4％時，隨著接種量的逐步遞增，混合菌群對苯胺降解率逐步提高；當混合菌群接種量達到6％后，苯胺的降解效果無明顯變化。推測當接種量較少時，由于底物相對較多，從而延長了菌群的延滯期，導致苯胺的降解效果不高；隨著接種量的提高，底物對菌群的抑制作用逐漸降低，使得延滯期縮短；但接種量過大時，菌群的數(shù)量已經(jīng)達到最大，對苯胺的降解能力也達到最高，所以沒有明顯的提高。

3　結(jié)論

本研究在環(huán)境樣品中馴化出在好氧條件下對苯胺進行降解的混合菌群，經(jīng)過分子學鑒定后，該混合菌群屬于沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、大腸桿菌屬、勒克氏菌屬；該混合菌群可在好氧條件下較好地降解苯胺。理化因素對混合菌群的影響顯示，該混合菌群在2 g/L的可溶性淀粉，1 g/L的氯化銨，混合菌群的接種量為4％時，混合菌群對苯胺的降解率高達95％，而最初的降解培養(yǎng)基在培養(yǎng)20 h時，苯胺降解率為21.15％，優(yōu)化后降解率提高了76.4％。研究表明，該篩選的混合菌群可以高效地降解苯胺，具有潛在的應用價值。

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Acclimation of Aniline Degradation Bacteria and the Optimization of Cultivated Conditions

ZHANG Miao，CUI Daizong，ZHANG Hao，*ZHAO Min
（Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China）

Abstract：Through special domestication，mixture strains which could efficiently degrade aniline are isolated from the soil which is endured the pollution of aniline. By analysis of the molecular biology of the 16S rDNA sequence，the strains belonged to Serratia marcescens，Bacillus，Escherichia coli.，Leclercia tamura，respectively. Base on the principle of a single variable factor，this study optimizes the degradation of medium carbon sources，nitrogen sources and the corresponding dosage，inoculum size. The experiments show that the best carbon source for degradation of aniline is starch，whose best concentration is 2 g/L；the growth best nitrogen source is ammonium chloride，whose optimal culture concentration is 1 g/L；the best vaccination is 4％. Optimized aniline degradation is 95％，with an increasing of 76.4％，exhibiting a remarkable degradation capability. This study is meaningful to seek for the approach on degradation of aniline efficiently.

Key words：aniline degradation；strains identification；optimization of culture medium

*通訊作者：趙敏（1964—），男，博士，教授，研究方向為環(huán)境微生物。

作者簡介：張淼（1989—），女，碩士，研究方向為環(huán)境微生物。

收稿日期：2015- 12- 11

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0018- 04

中圖分類號：X132

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.005