陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

梁寧利，巨亞杰，馮艷蕓，鞏蓬勃

（寶雞出入境檢驗檢疫局，陜西寶雞　721006）

?

陜西省地方酸奶中乳酸菌的分離鑒定及耐藥性分析

梁寧利，巨亞杰，馮艷蕓，鞏蓬勃

（寶雞出入境檢驗檢疫局，陜西寶雞721006）

摘要：從5種陜西省市售地方酸奶中分離出乳酸菌，研究乳酸菌分離株對多西環(huán)素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素以及紅霉素這7種抗生素的耐藥性。利用MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基，通過劃線分離培養(yǎng)分離酸奶樣品中的乳酸菌，對分離株進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色初級鑒定，同時采用紙片擴散法進(jìn)行耐藥性對比。從5種品牌酸奶中共分離出5株菌株，包括桿菌4株、球菌1株，用紙片擴散法進(jìn)行耐藥性測定均沒有檢測到獲得性耐藥表型。

關(guān)鍵詞：保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；分離；耐藥性

0　引言

酸奶是以鮮奶為原料，經(jīng)過巴氏殺菌后添加發(fā)酵劑發(fā)酵后，再冷卻灌裝的一種發(fā)酵乳制品。乳酸菌作為主要發(fā)酵劑，因其良好的發(fā)酵性能和益生功效在發(fā)酵食品行業(yè)中占有不可替代的位置。乳酸菌是指發(fā)酵糖類，主要代謝產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌有較長的安全使用歷史，長期以來發(fā)酵產(chǎn)品中所使用的乳酸菌普遍被人們認(rèn)為是安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株，并且它還與人以及動物腸道內(nèi)生微生物群落存在著相互作用，產(chǎn)生益生作用，有益于人和動物的健康[2]。2002年，國際乳業(yè)聯(lián)合會公布的在發(fā)酵乳制品中有長期安全使用歷史的微生物名單中細(xì)菌有18個屬81個種，其中乳桿菌有36個種、雙歧桿菌有8個種[3]。德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌是目前制作酸奶的主要發(fā)酵劑，所有酸奶的標(biāo)簽上都標(biāo)注有這2種乳酸菌。

近幾十年來，抗生素在醫(yī)療、獸醫(yī)以及動物飼料等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，甚至出現(xiàn)了濫用現(xiàn)象，導(dǎo)致微生物耐藥問題日趨嚴(yán)重，使人們在應(yīng)對細(xì)菌感染疾病時將面臨前所未有的挑戰(zhàn)[4]。早期有關(guān)細(xì)菌耐藥的研究主要集中在病原微生物的研究上，但是近些年對于環(huán)境中的共生細(xì)菌以及以乳酸菌為代表的益生菌耐藥的關(guān)注越來越多[5-6]。在研究初期，學(xué)者們認(rèn)為，乳酸菌的耐藥對其定植于人類或動物腸道內(nèi)發(fā)揮益生功效有一定的幫助，但隨后越來越多的報道顯示乳酸菌的耐藥機制與許多病原菌的耐藥機制十分相似。已有報道稱某些乳酸菌攜帶耐藥基因且具有相應(yīng)的耐藥表型[7]，如Mathur，Hummel以及Cataloluk等人就在發(fā)酵食品中檢測到紅霉素和四環(huán)素的耐藥基因[2，5，8]；在生產(chǎn)酸奶用的乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的某些菌株中也檢測到一些耐藥基因[5]。這些乳酸菌作為益生菌在進(jìn)入人體后（尤其是腸道），有將耐藥基因水平傳播給體內(nèi)的其他細(xì)菌，包括條件致病菌和致病菌的可能性[9]，從而對人類健康產(chǎn)生潛在的威脅。因此，是否具有耐藥性或攜帶耐藥基因已經(jīng)成為評價益生菌安全與否的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[10]。

近年來，國內(nèi)外越來越多的研究表明，長期以來被認(rèn)為安全的、廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品領(lǐng)域的乳酸菌已經(jīng)產(chǎn)生耐藥并攜帶了相應(yīng)的耐藥基因。因此，通過研究陜西地區(qū)市售酸奶樣品中乳酸菌，對7種具有代表性奶牛常用抗生素的耐藥性進(jìn)行對比，為評價酸奶中乳酸菌菌株的安全性及篩選安全菌株提供一定的參考依據(jù)。

1試驗材料與試劑

1.1試驗材料

5種陜西地方市售酸奶，購自寶雞人人樂超市，分別為A，B，C，D，E品牌。

1.2試驗試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、檸檬酸二胺、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫- 80、瓊脂、碳酸鈣、醋酸、大豆蛋白胨、乳糖、中性紅、蒸餾水、氯化鈉、甲苯胺藍(lán)，以及K2HPO4，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O均為市售分析純。

1.3試驗儀器

恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，日本ALP公司產(chǎn)品；PHS- 3C型pH計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UX6200H型分析天平，北京賽多利斯儀器系列有限公司產(chǎn)品。

2試驗方法

2.1培養(yǎng)基的配制

（1）MRS瓊脂培養(yǎng)基的配制。①材料：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二胺2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫- 80 1 mL，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，MgSO4· 7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g。②制法：將以上成分加入到蒸餾水中，加熱使完全溶解，調(diào)pH值6.2～6.4，分裝于三角瓶中，于121℃下高壓滅菌21 min。將MRS培養(yǎng)基用醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.4，制成酸化MRS培養(yǎng)基，將MRS培養(yǎng)基除去瓊脂，制得液態(tài)MRS培養(yǎng)基。

（2）改良MC培養(yǎng)基的配制。①材料：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂15.0 g，中性紅0.05 g。②制法：將以上成分加入到蒸餾水中，加熱使完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，于121℃條件下滅菌20 min。

2.2酸奶梯度稀釋

吸取1 mL酸奶于9 mL的生理鹽水中混勻，此為1×10-1稀釋液；再取1×10-1稀釋液1 mL于9 mL生理鹽水中，此為1×10-2稀釋液。以此類推，做到1×10-6梯度（此操作均在無菌條件下進(jìn)行）。

2.3 5種品牌酸奶中乳酸菌的活菌數(shù)計數(shù)

取上述6個連續(xù)稀釋度的稀釋液0.1 mL分別置于2個MRS瓊脂平板上，使用L形棒進(jìn)行表面涂布，倒置41℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h（從樣品稀釋到平板涂布整個試驗過程要求在20 min內(nèi)完成）。選取菌落數(shù)為30～300的平板進(jìn)行計數(shù)，計數(shù)方法是每1 mL樣品中的乳酸菌數(shù)=該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)×稀釋倍數(shù)。方法參考國標(biāo)GB/T 4789.35—2010。

2.4 5種品牌酸奶中乳酸菌的分離純化

乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征見表1。

表1　乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征

根據(jù)乳酸菌在MRS培養(yǎng)基上菌落特征，挑選3個或3個以上可疑單菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC培養(yǎng)基，保加利亞乳桿菌接種于加碳酸鈣（按3％ M/V的量加入滅菌碳酸鈣）并酸化的MRS培養(yǎng)基，倒置41℃兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

2.5乳酸菌的純培養(yǎng)

酸奶中保加利亞乳桿菌在酸化的MRS培養(yǎng)基上菌落直徑為1～3 mm，無色素，呈白色至淡灰色，菌落表面較粗糙，菌落周圍產(chǎn)生碳酸鈣的溶解圈[11]。酸奶中嗜熱鏈球菌在MC培養(yǎng)基上可見紅色菌落，表面光滑、邊緣整齊，菌落大小為2 mm左右[12]。每種菌種挑選3個可疑菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，每個菌落接種3個斜面培養(yǎng)基，置于41℃下兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

2.6乳酸菌純種的形態(tài)鑒定

從斜面培養(yǎng)基上選取單菌落進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。保加利亞乳桿菌菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀，彎曲桿狀或短桿狀，無芽孢。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑0.5～2.0 mm，成對或呈鏈排列，無芽孢。

2.7乳酸菌濃度的確定

2.7.1接種

用接種環(huán)無菌操作取保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1～2環(huán)分別放入200 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于41℃下恒溫培養(yǎng)。

2.7.2培養(yǎng)

分別于0，4，6，8，10，12，16，20 h取出10 mL培養(yǎng)液放冰箱中儲存，待測定。

2.7.3活菌計數(shù)

將待測試樣進(jìn)行梯度稀釋至10-5，取0.2 mL按GB/T 4789.35—2010進(jìn)行乳酸菌活菌數(shù)檢驗，以活菌數(shù)為1.50×108CFU/mL的時間為最佳培養(yǎng)時間。

2.8含菌培養(yǎng)基的制備

用無菌棉簽沾取菌液，在試管內(nèi)壁擠壓出多余液體后，涂布MRS平板，連續(xù)涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)60°，最后繞平板邊緣涂抹1周，將平皿蓋微開3～5 min，待培養(yǎng)基表面多余水分被吸收后，蓋上平皿蓋，配置好的菌懸液應(yīng)在15 min內(nèi)使用。

2.9乳酸菌的耐藥性測定

每個培養(yǎng)皿取一個位置為基準(zhǔn)點，并用記號筆在背面做上標(biāo)記，抗菌藥物紙片以順時針方向貼加，其順序為多西環(huán)素、萬古霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素以及紅霉素。用鑷子貼抗菌藥物紙片，每次鑷子夾紙片前灼燒滅菌，紙片貼上后輕壓確保其貼牢，紙片貼后位置不應(yīng)再移動。兩紙片中心距離＞24 mm，紙片距平板內(nèi)緣＞15 mm。置于41℃下兼性厭氧培養(yǎng)48 h。

2.10乳酸菌耐藥性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

用刻度尺量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）報告[13]判斷細(xì)菌對該抗生素是敏感（susceptible S）、耐藥（resistant R）還是中介（intermediate I）。

細(xì)菌耐藥性解讀標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2　細(xì)菌耐藥性解讀標(biāo)準(zhǔn)

3結(jié)果與分析

3.1 5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量見表3。

表3　5種品牌酸奶中乳酸菌的含菌量

由表3可以看出，A品牌酸奶中乳酸菌活菌數(shù)最多，其次是D品牌，乳酸菌數(shù)最少的是品牌E。國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的酸奶國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.35—2010）中規(guī)定[14]，產(chǎn)品中的乳酸菌數(shù)不得低于1×106CFU/mL。其中，低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有1份樣品，這可能是由于該菌種的耐氧性能較差，而在試驗過程中無法提供嚴(yán)格厭氧環(huán)境；但也不排除在添加菌種的過程中，沒有做好品質(zhì)控制，混勻不均，致使不同批次產(chǎn)品中含有的益生菌數(shù)量不同；同時，也不排除菌株自身品質(zhì)的問題。

3.2乳酸菌的初步鑒定

從5種品牌分離純化菌株的初步鑒定試驗結(jié)果。

菌株1.1122見圖1，菌株1.2122見圖2，菌株1.3121見圖3，菌株1.5121見圖4，菌株1.3232見圖5。

圖1　菌株1.1122

圖2　菌株1.2122

圖3　菌株1.3121

圖4　菌株1.5121

圖5　菌株1.3232

對酸奶樣品進(jìn)行分離后，共得到5株純菌株，其菌落特征與乳酸菌符合。甲苯胺藍(lán)染色鏡檢初步判斷其中菌株1.1122、菌株1.2122、菌株1.3121及菌株1.5121為桿菌，菌株1.3232為球菌，總之共獲得桿菌4株、球菌1株。獲得純的球菌明顯少于桿菌，原因可能是球菌對桿菌的依賴性更強，離開桿菌球菌很難生長；也可能是在分離過程中使用的培養(yǎng)基對球菌的選擇性更差。

3.3細(xì)菌濃度的確定

乳酸菌達(dá)到0.5麥?zhǔn)希?.50×108CFU/mL）濃度時所需要的培養(yǎng)時間見表4。

表4　乳酸菌達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠞舛葧r所需要的培養(yǎng)時間

由表4可以看出，對乳酸菌進(jìn)行液體培養(yǎng)后，乳酸菌的對數(shù)生長期在6～14 h，找到A，B，C這3種品牌的乳酸菌培養(yǎng)時間為8 h時，細(xì)菌濃度達(dá)1.50× 108CFU/mL；D與E這2種品牌的乳酸菌培養(yǎng)時間為10 h，細(xì)菌濃度達(dá)1.50×108CFU/mL。

3.4乳酸菌的耐藥性測定結(jié)果

菌株1.1122的耐藥性見圖6，菌株1.2122的耐藥性見圖7，菌株1.3121的耐藥性見圖8，菌株1.5121的耐藥性見圖9，菌株1.3232的耐藥性見圖10，乳酸菌的耐藥情況見表5。

圖6　菌株1.1122的耐藥性

圖7　菌株1.2122的耐藥性

圖8　菌株1.3121的耐藥性

圖9　菌株1.5121的耐藥性

圖10　菌株1.3232的耐藥性

表5　乳酸菌的耐藥情況

由表5可以看出，5株菌株均對鏈霉素耐藥，沒有菌株對頭孢吡肟、四環(huán)素、紅霉素以及多西環(huán)素耐藥；以上結(jié)果與秦宇軒和李晶等人[15]的報道一致。3株菌株對慶大霉素和萬古霉素耐藥。所檢測的5株乳酸菌均對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)為敏感，這與Charteris，Coppola和Zhou等人[16-18]的研究結(jié)果一致。乳酸菌對氨基糖苷類抗生素和萬古霉素的耐受性屬于天然耐藥，檢測的5株乳酸菌均對鏈霉素表現(xiàn)為耐藥，有3株對慶大霉素表現(xiàn)為耐藥，有3株對萬古霉素耐藥，以上結(jié)果與Mathur，Hummel和Danielsen等人[19-21]的報道一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]任大勇，李昌，秦艷青，等.乳酸菌益生功能及作用機制研究進(jìn)展[J] .中國獸藥雜志，2011，45（2）：47-50.

[2]周凌華，王豪，王蔭榆，等.功能性益生乳酸菌的研究進(jìn)展[J] .天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（7）：990-997.

[3]吳妍妍，張文舉，胡猛，等.乳酸菌在動物營養(yǎng)中的研究進(jìn)展[J] .飼料博覽，2012（10）：20-23.

[4]Orberg P K，Sandine W E. Survey of antimicrobial resistance in lactic streptococci [J] . Applied and Environmental Microbiology，1985，49（3）：538-542.

[5]Hempel A S，Newberry S J，Maher A R，et al. Probiotics for the prevention and treatment of antibiotic-associated diarrhoea：a systematic review and meta-analysis [J] . The Journal of the American Medical Association，2012，307（18）：1 959-1 969.

[6]張灼陽，劉暢，郭曉奎.乳酸菌耐藥性的研究進(jìn)展[J] .中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（5）：478-480.

[7]馮大偉，周家春.益生乳酸菌的紙片擴散法藥敏性試驗評價[J] .微生物學(xué)通報，2010，37（3）：454-464.

[8]徐進(jìn)，劉秀梅，楊寶蘭，等.中國常用益生菌菌種的耐藥性研究[J] .衛(wèi)生研究，2008，37（3）：354-356.

[9]李平蘭，潘偉好，呂艷妮，等.微生態(tài)制劑中常用乳酸菌對抗生素的藥敏性研究[J] .中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，9（1）：16-20.

[10]凡琴，劉書亮，李娟，等.中國市售酸奶乳酸菌的耐藥性分析[J] .衛(wèi)生研究，2012，41（3）：476-479.

[11]李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實驗原理與計數(shù)[M] . 第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：35-37.

[12]彭磊，司麗紅.酸奶中嗜熱鏈球菌初步分離與鑒定[J] .現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（15）：359-360.

[13]陳佳玉，梁勇.臨床檢驗實驗系列教程微生物學(xué)檢驗分冊[M] .杭州：浙江大學(xué)出版社，2010：7.

[14]衛(wèi)生部. GB/T 4789.35—2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗－食品中乳酸菌檢驗[S] .北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[15]秦宇軒，李晶.市售酸奶中乳酸菌的鑒定與耐藥性[J] .微生物學(xué)報，2013，53（8）：889－897.

[16]Charteris W P，Kelly P M，Morelli L，et al. Antibiotic susceptibilityofpotentiallyprobiotic Lactobacillusspecies [J] . Journal of Food Protection，1998，61（12）：1 636-1 643.

[17]Coppola R，Succi M，Tremonte P，et al. Antibiotic susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from parmigiano reggiano cheese [J] . Le Lait，2005，85（3）：193-204.

[18]Zhou J S，Pillidge C J，Gopal，P K，et al. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains [J] . International Journal of Food Microbiology，2005，98（2）：211-217.

[19]Mathur S，Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria a review [J] . International Journal of Food Microbiology，2005，105（3）：281-295.

[20]Hummel A S，Hertel C，Holzapfel W H. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria [J] . Applied and Environmental Microbiology，2007，73（3）：730-739.

[21]Danielsen M，Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents [J] . International Journal of Food Microbiology，2003，82（1）：1-11.

Shaanxi Province where the Separation of Lactic Acid Bacteria in Yogurt Identification and Drug Resistance Analysis

LIANG Ningli，JU Yajie，F(xiàn)ENG Yanyun，GONG Pengbo
（Baoji Entry- exit Inspection and Quarantine Bureau，Baoji，Shaanxi 721006，China）

Abstract：This paper from 5 kinds of lactic acid bacteria is isolated in shaanxi provinces and cities selling place of yogurt，the separation of lactic acid bacteria strains to doxycycline，vancomycin，cefepime，gentamycin，tetracycline，streptomycin and erythromycin the 7 kinds of antibiotic resistance. Using MRS culture medium and cultivated by streak MC medium separation of lactic acid bacteria in yogurt samples，toluidine blue staining the primary identification of the isolates，resistance comparison by disc diffusion method at the same time. Isolated from five brand yogurt of the communist party of China from 5 strains，4 strains bacillus，staphylococcus aureus 1 strain，by disc diffusion method for determination of resistance acquired drug resistance phenotypes are not detected.

Key words：Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilic；separate；drug resistance

作者簡介：梁寧利（1981—），女，本科，工程師，研究方向為食品檢測。

收稿日期：2016- 01- 14

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0040- 04

中圖分類號：R155.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.011