王雪竹,吳順紅,趙光遠(yuǎn)

(1.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州　450000)

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超高壓提取女貞子總?cè)乒に嚄l件的優(yōu)化

王雪竹1,吳順紅2,趙光遠(yuǎn)2

(1.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心;2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450000)

摘要：目的優(yōu)化超高壓提取女貞子總?cè)频墓に嚄l件，并且同回流提取和超聲提取方法進(jìn)行比較。方法以女貞子為原料, 總?cè)频寐蕿橹笜?biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，從粉碎度、超高壓壓力、時(shí)間、固液比(g∶mL)四個(gè)方面對(duì)提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果最佳工藝條件為：粉碎度60目、壓力400 MPa、 提取4 min、 固液比1∶15。在最佳的條件下，總?cè)频牡寐蕿?.08%，回流提取和超聲提取的得率分別為5.82%和5.68%。結(jié)論超高壓提取方法較回流提取和超聲提取的得率高，且提取時(shí)間短，是女貞子總?cè)铺崛〉倪m宜方法。

關(guān)鍵詞：女貞子；總?cè)?；超高壓提取；工藝?yōu)化

女貞子為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的干燥成熟果實(shí)[1]。女貞子中含有三萜類、黃酮類、多糖類、醚萜類等多種活性成分[2-5]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等功能作用[6-9]。三萜類化合物是女貞子中主要的活性成分[10-12]。因此，提取女貞子中三萜成分對(duì)開發(fā)利用女貞子具有重要意義。

潘晴等[13]用80%的乙醇回流，石油醚萃取從石油醚部分中鑒定了齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、19α-羥基-3-乙酰烏索酸三個(gè)成分；張靜等[14]采用超聲提取的方法，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了超聲提取對(duì)女貞子三萜類化合物的影響。但微波提取和超聲提取易造成部分成分的破壞。近年來，超高壓提取方法在天然產(chǎn)物的功能成分提取上得到應(yīng)用，其提取時(shí)間短、提取得率高[15-18]。但采用超高壓提取女貞子總?cè)?，目前還少見報(bào)道。正交實(shí)驗(yàn)法是天然產(chǎn)物提取工藝中較好的工藝優(yōu)化方法[19-20]，本研究擬采用超高壓提取女貞子總?cè)?，?duì)其提取工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，并且同回流提取和超聲提取方法進(jìn)行比較，以期為女貞子資源的利用提供理論支撐。

1材料

女貞子于2015年12月采自鄭州，由鄭州輕工業(yè)學(xué)院縱偉教授鑒定為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit. )，干燥粉碎后備用；UHP900×2-Z超高壓處理裝置，購(gòu)自包頭科發(fā)公司；R-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自上海申勝生物技術(shù)有限公司。乙醇、乙酸乙酯等為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1女貞子總?cè)瞥邏禾崛?女貞子粉碎后加入一定量的無水乙醇，混勻后裝入聚乙烯塑料袋，雙層封口后放入超高壓容積腔中，超高壓處理一定時(shí)間后取出，剪開塑料袋，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得女貞子總?cè)拼痔崛∥?，然后測(cè)定其中的總?cè)坪?，?jì)算其中女貞子總?cè)瀑|(zhì)量。按下式計(jì)算女貞子總?cè)频牡寐省?/p>

女貞子總?cè)频牡寐?%)=女貞子總?cè)?女貞子質(zhì)量×100%

2.2總?cè)坪康臏y(cè)定采用薄層色譜分離—紫外分光光度法測(cè)定女貞子總?cè)坪?。首先配?1.00 g·L-1的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，依次量取0、20、40、60、80、100 μL的熊果酸甲醇溶液，在將經(jīng)活化的0.5%(w/v)羧甲基纖維素鈉—硅膠G薄板分成左右二個(gè)區(qū)域，在其中一個(gè)區(qū)域上點(diǎn)樣，同時(shí)在另外一個(gè)區(qū)域點(diǎn)上相同的溶液作為對(duì)照，然后在層析缸中以甲醇∶氯仿=3∶1為展開劑展開，展開后揮干溶劑，在對(duì)照樣的相應(yīng)的部分噴10%(v/v)硫酸乙醇，然后放在烘箱中，以105℃顯色10 min，對(duì)照樣顯色后刮取于紅紫色部分相對(duì)應(yīng)的樣品樣部分的相應(yīng)條帶，以甲醇為溶劑進(jìn)行浸泡2 h ,5 000 r·min-1離心15 min后收集上清，85℃水浴蒸干甲醇，然后加0.3 mL的5%(w/v)香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，在60℃下反應(yīng)15 min,然后冰水冷卻，加5 mL冰醋酸，在542 nm測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，繪制吸光度和三萜含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：Y=0.004 3X+0.005，其中X為含量(μg)，Y為吸光度，R2=0.999。

圖1　三萜化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3超高壓提取單因素試驗(yàn)選擇粉碎度、超高壓壓力、保壓時(shí)間、固液比(g∶mL)四個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在固定三個(gè)因素水平的前提條件下，對(duì)剩余一個(gè)影響因素進(jìn)行單因素研究，其固定條件為：粉碎度60目、壓力400 MPa、時(shí)間4 min、固液比1∶15(g∶mL)。

2.3.1粉碎度對(duì)總?cè)频寐实挠绊懺诔邏簤毫?00 MPa、保壓時(shí)間4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，對(duì)不同粉碎度的女貞子進(jìn)行提取，粉碎度對(duì)得率的影響如圖2所示。

圖2　粉碎度對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

在60目前，總?cè)频寐孰S粉碎度的增加而增加，但達(dá)到60目后，繼續(xù)增加粉碎程度，得率略有下降。這是因?yàn)榉鬯槎冗_(dá)到一定程度后，繼續(xù)粉碎，細(xì)胞過度破壞，導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出，影響總?cè)迫艹觥Ｒ虼耍?0目粉碎度較適宜。

2.3.2壓力對(duì)總?cè)频寐实挠绊懺?0目粉碎度、超高壓保壓時(shí)間4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，不同超高壓壓力對(duì)總?cè)频寐实挠绊懭鐖D3所示。

如圖3所示，400 MPa前，總?cè)频寐孰S壓力的增加而增加，壓力高于400 MPa后，總?cè)频寐孰S壓力增加而略下降。這是因?yàn)槌邏合?，?xì)胞發(fā)生形變導(dǎo)致破壞，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的有效成分溶出。但壓力過大，細(xì)胞過度破壞，導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出，影響總?cè)迫艹?。因此，壓力選擇400 MPa為宜。

圖3　超高壓壓力對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

2.3.3保壓時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊懺?0目粉碎度、400 MPa、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，不同處理時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊懭鐖D4所示。

如圖4所示，4 min前, 總?cè)频寐孰S時(shí)間增加而增加，超過4 min后，得率變化較小。這是因?yàn)? min時(shí)，已造成女貞子細(xì)胞的破壞，繼續(xù)增加時(shí)間，細(xì)胞過度破壞，導(dǎo)致大量雜質(zhì)溶出，影響總?cè)迫艹?。因此，保壓時(shí)間選擇4 min。

圖4　保壓時(shí)間對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

2.3.4固液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊懺?0目粉碎度、400 MPa、保壓時(shí)間4 min的條件下，不同固液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊懭鐖D5所示。

圖5　固液比對(duì)總?cè)频寐实挠绊?/p>

如圖5所示，1∶15 (g∶mL)前, 總?cè)频寐孰S溶劑用量增加而增加，超過1∶15后，得率增加緩慢。這是因?yàn)槿軇┯昧看?，女貞子?xì)胞壁內(nèi)外兩側(cè)的三萜化合物濃度差大，有利于其擴(kuò)散和溶出，但過大的固液比在實(shí)際使用中會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的濃縮工序負(fù)擔(dān)較大，因此，固液比選擇1∶15。

2.4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)女貞子三萜的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素與水平表見表1。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由極差R分析可知，各因素對(duì)女貞子總?cè)频寐视绊懙拇涡驗(yàn)椋撼邏簤毫?粉碎度>保壓時(shí)間>固液比。最佳提取條件為 A2B2C2D2，即：粉碎度60目、壓力400 MPa、時(shí)間4 min、固液比1∶15。對(duì)表2進(jìn)行的方差分析結(jié)果見表3。從表3可見，粉碎度和超高壓壓力對(duì)女貞子總?cè)频寐试谒疾斓姆秶鷥?nèi)影響顯著，保壓時(shí)間和固液比對(duì)女貞子總?cè)频寐试谒疾斓姆秶鷥?nèi)影響不顯著。

2.5工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選的工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，以優(yōu)化工藝作為標(biāo)準(zhǔn)提取總?cè)疲寐识驾^高，總?cè)频寐史謩e為6.07%、6.08%、6.09%，總?cè)频寐实钠骄禐?.08%。試驗(yàn)結(jié)果表明，所優(yōu)化的提取工藝合理可行，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.6三種提取方法的比較參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行女貞子總?cè)苹亓魈崛?，取已粉碎好的女貞?(60目)100.0 g，裝入乙醇回流瓶?jī)?nèi)，加入90%乙醇連續(xù)回流120 min，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得回流提取的女貞子總?cè)啤?/p>

參照文獻(xiàn)[20-21]進(jìn)行女貞子總?cè)瞥曁崛?，取已粉碎好的女貞?(60目)10.0 g，加入100 mL 90%乙醇的乙醇，在提取溫度75℃、液固比1∶15、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%超聲功率 480W條件下提取25 min，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得超聲提取提取的女貞子總?cè)啤?/p>

三種提取方法的總?cè)频寐时容^見圖6。

表1　因素與水平表

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

圖6三種提取方法的比較

由圖6可見，回流提取和超聲提取的得率分別是5.82%和5.68%，三種提取方法的時(shí)間分別是超高壓提取4 min ,超聲提取25 min，回流提取120 min。超高壓提取方法的得率較回流提取得率高，且提取時(shí)間較超聲提取和回流提取時(shí)間短。

3討論

超高壓提取總?cè)频寐矢撸瑫r(shí)間短，是由于植物在超高壓下，細(xì)胞快速發(fā)生形變，當(dāng)壓力突然泄除后，細(xì)胞內(nèi)外的壓差變化，導(dǎo)致細(xì)胞快速破壞，使得細(xì)胞內(nèi)的三萜成分溶出過程的傳質(zhì)阻力減小，得率得到提高[22]。但在超高壓下，提供的能量不會(huì)破壞共價(jià)鍵，因此，三萜成分不會(huì)破壞。

在超高壓提取植物有效成分的過程中，粉碎度、超高壓壓力、保壓時(shí)間、固液比和溶劑濃度是影響提取得率的主要因素。本實(shí)驗(yàn)得到超高壓提取女貞子總?cè)频淖罴压に嚄l件為：粉碎度60目、超高壓壓力400 MPa 、時(shí)間4 min和固液比1∶15。在最佳的提取條件下，女貞子總?cè)频寐士蛇_(dá)6.08%，回流提取和超聲提取的得率分別是5.82%和5.68%，三種提取方法的時(shí)間分別是超高壓提取4 min ,超聲提取25 min，回流提取120 min,超高壓提取方法的得率較回流提取得率高，且提取時(shí)間較超聲提取和回流提取時(shí)間短。因此，超高壓提取方法是女貞子總?cè)铺崛〉倪m宜方法。

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Extraction conditions optimization of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi

WANG Xue-zhu1,WU Shun-hong2,ZHAO Guang-yuan2

(1.HenanProvincialFoodandDrugInspectionCenter;2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou,Henan450000,China)

Abstract:Objective To optimize extraction conditions of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi and comparing with reflux extraction and ultrasonic extraction method . Methods Using Fructus Ligustri Lucidi as material and yields of total triterpenes as indexes, extraction conditions such as grinding degree, pressure, time, and the ratio of solid to liquid were optimized by signal factors test and orthogonal test.Conclusions Optimum extraction conditions were as follows: grinding degree 60 mesh, pressure 400 MPa, time 4 min and stock ratio 1∶15 (g∶mL). Under optimum extraction conditions, the yield of total triterpenes was 6.08%.The yield of reflux extraction and ultrasonic extraction were 5.82% and 5.68%, respectively. Conclusions Ultra high pressure extraction method has higher yield than the yield of reflux extraction and ultrasonic extraction method, and has shorter time than reflux extraction and ultrasonic extraction method. So, Ultra high pressure extraction method was a suitable method for total triterpenes extraction from Fructus Ligustri Lucidi.

Key words:Fructus Ligustri Lucidi;total triterpenes;ultra high pressure extraction;technology optimization

(收稿日期：2016-01-18，修回日期：2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.007

基金項(xiàng)目：2015年河南省創(chuàng)新型科技團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No C20150024)