人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性

陸　源，　陳　偉，　李利云，　彭榮剛，　李　菲，　鄔敏辰（.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫4；.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無(wú)錫4；.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫4）

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人白介素-29變異體在畢赤酵母中的表達(dá)及抗腫瘤活性

陸源1，陳偉*2，李利云3，彭榮剛2，李菲2，鄔敏辰2
（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

摘要：基于生物信息學(xué)分析的結(jié)果，采用基因突變和大引物PCR技術(shù)完成人白細(xì)胞介素-29 （hIL-29）成熟肽第33位氨基酸的定點(diǎn)突變，成功實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母（Pichiapastoris）GS115中的異源表達(dá)。重組人白細(xì)胞介素-29變異體蛋白（rhIL-29mut33）在不同質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7402、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8和胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖均有抑制作用，而且抑制增殖效應(yīng)強(qiáng)于野生型rhIL-29。與低質(zhì)量濃度相比，高質(zhì)量濃度下rhIL-29mut33對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)，對(duì)上述3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到（31.76±2.87）%、（22.47±0.26）%和（34.41± 0.40）%。rhIL-29mut33良好的生物學(xué)活性表明該變異體具有較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：人白細(xì)胞介素-29；定點(diǎn)突變；基因克隆；表達(dá)；抗腫瘤活性

人白細(xì)胞介素-29（Human interleukin-29，hIL-29）是近年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，又稱為干擾素λ1 （Interferon λ1，IFNλ1），其與hIL-28A和hIL-28B同屬I(mǎi)FN λ家族（IFNλs）[1-2]。hIL-29通過(guò)結(jié)合特殊的異二聚體受體復(fù)合物起始信號(hào)的傳導(dǎo)，其與Ⅰ型IFN共享相同的JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)一組共同基因的表達(dá)。因此，hIL-29表現(xiàn)出一些與Ⅰ型IFN相同的性質(zhì)，如抗病毒、抗增殖、體內(nèi)抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性[3]。hIL-29的特異受體復(fù)合物由特有的結(jié)合亞基IL-28R1和輔助亞基IL-10R2組成。IL-28R1表達(dá)的細(xì)胞譜系較少，因此，hIL-29作用的靶細(xì)胞有限，主要包括肝細(xì)胞、胃腸細(xì)胞和上皮細(xì)胞[4-8]。由此提示hIL-29作為藥物的副作用可能比Ⅰ型IFN更小，可望研制開(kāi)發(fā)臨床療效高且副作用小的新一代干擾素藥物。研究發(fā)現(xiàn)，hIL-29肽鏈中有一個(gè)由胞內(nèi)向胞外的跨膜結(jié)構(gòu)域，其空間構(gòu)象由6個(gè)α螺旋（A-F）和無(wú)規(guī)則卷曲組成[9]。hIL-29空間構(gòu)象的A、B和F螺旋可能是hIL-29與特異性受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的活性部位。對(duì)hIL-29的生物信息學(xué)分析表明，A和F螺旋中有4個(gè)氨基酸殘基可能是影響其生物學(xué)活性的關(guān)鍵氨基酸殘基[10]。

作者所在課題組前期已從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)RT-PCR得到hIL-29成熟肽的編碼基因，并獲得酵母表達(dá)的重組hIL-29成熟肽[11-12]。在此基礎(chǔ)上，作者以生物信息學(xué)分析結(jié)果為依據(jù)[10]，采用定點(diǎn)突變和大引物PCR技術(shù)將hIL-29成熟肽的Lys33定點(diǎn)改造為Arg33，將變異體hIL-29mut33通過(guò)畢赤酵母GS115重組表達(dá)，初步分析了重組hIL-29變異體（rhIL-29mut33）的抗腫瘤活性，結(jié)果顯示該變異體具有較好的抗腫瘤效應(yīng)。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

大腸桿菌E. coli JM109，真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM：購(gòu)自Invitrogen公司并經(jīng)作者所在實(shí)驗(yàn)室改造；整合了hIL-29成熟肽基因的重組質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29：由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；克隆質(zhì)粒pUCm-T：上海Sangon公司；畢赤酵母GS115：Invitrogen公司；人肝癌細(xì)胞BEL7402、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8及人胃癌細(xì)胞SGC7901：由江南大學(xué)藥學(xué)院金堅(jiān)教授惠贈(zèng)。

1.2主要試劑和培養(yǎng)基

各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶、DNA Ladder Marker、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和EZ-10柱式DNA回收試劑盒：大連TaKaRa公司；胰蛋白胨、酵母提取物、DAB、SDS、G418、硝酸纖維素膜（NC膜）和RPMI-1640培養(yǎng)基等：上海Sangon公司；羊抗人IL-29多克隆抗體：美國(guó)R&D公司；HRP標(biāo)記兔抗羊IgG：上海明睿公司；新生小牛血清：浙江天杭生物科技有限公司；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液（100×）和Cell Counting Kit-8試劑：碧云天生物技術(shù)研究所；重組人干擾素α2b注射液：北京凱因科技股份有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。LB、YPD、MD、BMGY 和BMMY培養(yǎng)基的配制按Multi -Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI公布的hIL-29的編碼序列（登錄號(hào)：AY336716.1），結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼hIL-29成熟肽cDNA的特異性上、下游引物及突變引物（第98位堿基T突變?yōu)镃）：

上游引物（hIL-29-F）：5’- CTCGAGAAAAGAG GCCCTGTCCCCACTTCC -3’，含XhoⅠ位點(diǎn)；

下游引物（hIL-29-R）：5’- GCGGCCGCTCAGG TGGACTCAGGGTGG -3’，含NotⅠ位點(diǎn)；

突變引物（hIL-29-A）：5’- CCCTGGCCCTCTT GAAGCTCGCTA -3’，含突變位點(diǎn)。

1.4 hIL-29mut33編碼基因的克隆

采用大引物PCR方法，對(duì)hIL-29成熟肽基因?qū)嵭卸c(diǎn)突變。第一輪PCR擴(kuò)增以pPIC9KM-hIL-29質(zhì)粒為模板，hIL-29-F和hIL-29-A為引物，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。第二輪大引物PCR擴(kuò)增以pPIC9KM-hIL-29質(zhì)粒為模板，以第一輪PCR產(chǎn)物和hIL-29-R為引物，反應(yīng)條件與第一輪相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳后，用EZ-10 Spin Column DNA Extraction Kit回收目的基因，操作按說(shuō)明書(shū)。將回收的目的基因與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送上海Sangon公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29mut33經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的基因hIL-29mut，與同樣雙酶切的pPIC9KM質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選鑒定獲重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29mut33后，送上海Sangon公司測(cè)序鑒定。

1.5 hIL-29mut33在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

pPIC9KM和經(jīng)測(cè)序鑒定的pPIC9KM-hIL-29mut33經(jīng)SalⅠ線性化后，用電轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115；轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115涂布MD平板，挑選在MD平板上生長(zhǎng)良好的菌落用牙簽點(diǎn)種至含不同質(zhì)量濃度G418的YPD平板，篩選出抗高質(zhì)量濃度（2.0 mg/mL）的重組畢赤酵母，分別命名為GS115/9KM和GS115/hIL-29mut33。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法提取重組GS115基因組DNA，以通用引物5’-AOX和3’-AOX進(jìn)行PCR，鑒定目的基因是否整合入GS115基因組內(nèi)。GS115/9KM和GS115/ hIL -29mut33的誘導(dǎo)表達(dá)按Multi -Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.6 rhIL-29mut33的分離純化

誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，收集上清液。向上清液中加入硫酸銨至30%飽和度，4℃靜置過(guò)夜后離心去除部分雜蛋白質(zhì)和色素。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至65%飽和度，4℃靜置過(guò)夜，離心收集沉淀。將沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（10 mmol/L，pH 6.0），經(jīng)透析、超濾濃縮（截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000，Millipore公司）后，加至預(yù)先用上述緩沖液平衡的SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱（Φ 16 mm×200 mm），以同樣緩沖液洗柱，然后以含NaCl的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（10 mmol/L，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl，pH 6.0）進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，收集洗脫液。將含有rhIL-29mut33的洗脫液超濾濃縮至3 mL，加至預(yù)先用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡的Sephadex G-75凝膠層析柱（Φ 1.6 cm×100 cm），然后同一緩沖液洗脫，流速0.4 mL/min，收集含rhIL-29mut33的組分，冷凍干燥。

1.7 rhIL-29mut33的鑒定

取少量純化后的重組蛋白凍干粉，用適量的無(wú)菌超純水溶解，采用SDS-PAGE對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分析及表觀相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。以Western Blot鑒定rhIL-29mut33是否表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用含10%健康兔血清的TBST緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L NaCl，土溫-20 0.05%，pH 7.2）于4℃封閉過(guò)夜，TBST清洗后用羊抗人IL-29抗體（1∶1 000）于37℃孵育2 h， TBST清洗后用HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（1∶2 500）于37℃孵育1 h，TBST清洗后用DAB試劑顯色。

1.8 rhIL-29mut33的HPLC純度鑒定

采用美國(guó)安捷倫公司的Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)，選擇色譜柱：Agilent C18，300 ?，5 μL反相柱。將純化蛋白質(zhì)的凍干粉用10 mmol/L，pH 7.0的PBS溶解，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為2 mg/mL以上，上樣量為20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，對(duì)各個(gè)吸收峰進(jìn)行積分，按面積歸一法計(jì)算hIL-29mut33的純度。

1.9 rhIL-29mut33的抗腫瘤活性分析

將rhIL-29mut33、野生型rhIL-29、陽(yáng)性對(duì)照IFN-α2b分別設(shè)置50、500、1 000 ng/mL 3個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)置空白和陰性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BEL7402、HCT8和SGC7901細(xì)胞，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL（空白孔不接種），置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸去上清液；取上述樣品用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋，分別按劑量組每孔加入100 μL，空白和陰性對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定A450，計(jì)算rhIL -29mut33對(duì)BEL7402、HCT8以及SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率，并運(yùn)用SPSS軟件22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析結(jié)果，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

IR（增殖抑制率）=1-樣品組A450值/陰性對(duì)照組A450值

2　結(jié)果與討論

2.1 hIL-29mut33基因的克隆

按照1.4中的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第一輪PCR產(chǎn)物，在約130 bp處有一明顯的條帶，見(jiàn)圖1泳道1。將目的產(chǎn)物回收純化。以第一輪PCR產(chǎn)物為大引物，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物在約560 bp處有一條特異性的條帶，見(jiàn)圖1泳道2。PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符，回收產(chǎn)物與pUCm-T連接的重組質(zhì)粒pUCm-T-hIL-29mut33，經(jīng)測(cè)序鑒定的結(jié)果顯示，基因大小為563 bp，編碼181個(gè)氨基酸，將其序列與hIL-29的編碼基因（登錄號(hào)：AY336716.1）比對(duì)顯示第98位堿基T突變?yōu)镃。將hIL-29mut33與pPIC9KM連接得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL-29mut33經(jīng)測(cè)序鑒定，結(jié)果表明目的基因沒(méi)有發(fā)生突變，且讀碼框完全正確。

圖1　hIL-29mut33的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplifications for hIL-29mut33

2.2 hIL-29mut33基因在畢赤酵母中的表達(dá)

按照1.5中的方法，將線性化的pPIC9KM-hIL-29mut33質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選獲得高拷貝的hIL-29mut33/GS115。將挑選的高拷貝hIL-29mut33/GS115重組子為模板，用引物5’-AOX和3’-AOX進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為2 100 bp和1 100 bp的產(chǎn)物，2 100 bp的產(chǎn)物為GS115本身的AOX1基因，1 100 bp的產(chǎn)物包括約為600 bp的目的基因（563 bp）和500 bp pPIC9KM質(zhì)粒上的5’-AOX和3’-AOX引物序列之間的片段，見(jiàn)圖2，表明hIL-29mut33基因已成功整合入酵母GS115基因組中。

2.3 rhIL-29mut33的表達(dá)和鑒定

挑取hIL-29mut33/GS115菌落常規(guī)誘導(dǎo)表達(dá)72 h，將發(fā)酵上清液按1.6中的方法經(jīng)鹽析、透析、超濾、SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析純化的產(chǎn)物，經(jīng)SDSPAGE分析表明，在約22 600處可見(jiàn)明顯的單一目的蛋白質(zhì)條帶，見(jiàn)圖3泳道3，而GS115/9KM的發(fā)酵液在該處并無(wú)相同條帶，見(jiàn)圖3泳道1。SDS-PAGE結(jié)果顯示，rhIL-29mut33的表觀相對(duì)分子質(zhì)量高于理論計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量（20018.0），這可能由于rhIL-29mut33在酵母GS115表達(dá)過(guò)程中發(fā)生了糖基化修飾[9]。用在線軟件NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu. dk/services/NetNGlyc/）和NetOGlyc 4.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分別對(duì)N和O糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明hIL-29mut33氨基酸序列中含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和8個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

圖2　重組畢赤酵母hIL-29mut33/GS115的PCR檢測(cè)Fig. 2　 PCR detections of recombinant P.pastoris hIL -29mut33/GS115

圖3　表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expressed products

hIL-29mut33/GS115的發(fā)酵上清液經(jīng)Western Blot分析，結(jié)果顯示，重組表達(dá)的rhIL-29mut33與羊抗人IL-29抗體反應(yīng)后在NC膜上呈現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，其大小約為22 600，見(jiàn)圖4，與SDS-PAGE中的條帶大小相符，但反應(yīng)條帶略有彌散，這可能是Western Blot的放大效應(yīng)所致。

圖4　rhIL-29mut33的Western Blot鑒定Fig. 4 Western Blotof rhIL-29mut33

2.4 rhIL-29mut33的HPLC純度鑒定

采用C18反相柱，在HPLC系統(tǒng)上檢測(cè)純化后rhIL-29mut33的純度。流動(dòng)相為：10%乙腈和0.5%三氟乙酸；洗脫條件為：0～10 min，10%～30%的乙腈和0.5%三氟乙酸；10～20 min，30%～70%的乙腈和0.5%的三氟乙酸。經(jīng)過(guò)面積歸一法計(jì)算，rhIL-29mut33的純度為95.13%，可以用于體外細(xì)胞活性的檢測(cè)。

2.5 rhIL-29mut33的抗腫瘤活性分析

按照1.9中的方法，rhIL-29mut33對(duì)BEL7402、HCT8和SGC7901三株腫瘤細(xì)胞的增殖抑制分析結(jié)果表明，各劑量組均顯示增殖抑制效應(yīng)，隨著rhIL-29mut33濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率均隨之增加，呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系，見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS軟件22.0，符合方差齊性和正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步做單因素方差分析；p＜0.05記作*，表示顯著性差異；p＜0.01記作**，表示極顯著差異。

表1　rhIL-29mut33對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的抑制作用Table 1　 Inhibition effects of rhIL -29mut33on different tumor cell lines

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut33、野生型rhIL-29及商品化的IFN-α2b對(duì)3株腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)略有差異，rhIL-29mut33在低、中、高劑量組對(duì)BEL7402細(xì)胞抑制作用均強(qiáng)于野生型rhIL-29及IFN-α2b，其高劑量組的抑制率達(dá)到（31.76± 2.87）%，見(jiàn)圖5，極顯著地抑制了BEL7402細(xì)胞的增殖。

圖5　rhIL-29mut33對(duì)BEL7402細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 5　 Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in BEL7402 cells

高劑量組的rhIL-29mut33、rhIL-29及IFN-α2b 對(duì)HCT8細(xì)胞的增殖抑制率分別為（22.47±0.26）%、（20.38±1.23）%和（27.16±1.22）%，表明rhIL-29mut33、rhIL-29對(duì)HCT8細(xì)胞的抑制效應(yīng)低于IFN-α2b，而rhIL-29mut33和rhIL-29對(duì)HCT8細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)差異不大，見(jiàn)圖6。

圖6　rhIL-29mut33對(duì)HCT8細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 6　 Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in HCT8 cells

對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖抑制分析結(jié)果顯示，rhIL-29mut33表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖抑制能力，rhIL-29mut33、rhIL-29及IFN-α2b的高劑量組對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制率分別為（34.41±0.40）%、（29.09±1.76）%和（27.74±1.25）%，見(jiàn)圖7。三者均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制效應(yīng)，但rhIL-29mut33的抑制作用更強(qiáng)，極顯著地抑制了SGC7901細(xì)胞的增殖。

圖7　rhIL-29mut33對(duì)SGC7901細(xì)胞的抗增殖活性分析Fig. 7　 Antiproliterative activities analysis of rhIL-29mut33in SGC7901 cells

分析結(jié)果表明，不同劑量組的變異體rhIL-29mut33對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，增殖抑制率也隨之增加。對(duì)于HCT8細(xì)胞，rhIL-29mut33的抑制作用強(qiáng)于野生型rhIL-29，但弱于商品化的IFN-α2b；而對(duì)于BEL7402和SGC7901細(xì)胞，rhIL-29mut33的抑制作用強(qiáng)于野生型rhIL-29和商品化IFN-α2b，表現(xiàn)出極顯著的抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)。

3　結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著對(duì)hIL-29生物學(xué)活性的研究日益廣泛和深入，hIL-29由于具有與IFN-α相似的抗病毒和抗腫瘤活性以及細(xì)胞靶向性而引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。已有研究表明，hIL-29的突變可以影響它的抗病毒和抗腫瘤活性，而且很多突變被假設(shè)且與受體聯(lián)系起來(lái)[13]。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)分析，采用定點(diǎn)突變方法對(duì)hIL-29 的A、F螺旋中4個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)之一的Lys33進(jìn)行分子改造，以改變hIL-29與受體結(jié)合的親和性，從而提高其生物學(xué)活性。

作者采用定點(diǎn)突變和大引物PCR技術(shù)成功克隆出hIL-29mut33的編碼基因并在畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，獲得的rhIL-29mut33表現(xiàn)出良好的抗增殖活性。對(duì)于BEL7402、HCT8和SGC7901這3種腫瘤細(xì)胞，不同劑量的rhIL-29mut33均具有抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)，而且對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用均強(qiáng)于野生型rhIL-29。同時(shí)隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率均隨之增加。高劑量的rhIL-29mut33對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，對(duì)上述3種細(xì)胞的細(xì)胞抑制率分別達(dá)到（31.76±2.87）%、（22.47±0.26）%和（34.41±0.40）%。本研究成果為hIL-29分子改造的深入研究奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為后續(xù)研制高效的干擾素抗腫瘤藥物提供參考。

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Expression of Recombinant Human Interleukin-29 Mutant in Pichia pastoris and Antitumor Analysis

LU Yuan1，CHEN Wei*2，LI Liyun3，PENG Ronggang2，LI Fei2，WU Minchen2
（1. School of Medicine Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Based on results of the bioinformatics analysis，a mutant of recombinant human interleukin 29（rhIL-29mut33）was constructed by site-directed mutagenesis and megaprimer PCR. Then，it was successfully expressed in Pichiapastoris GS115. The rhIL-29mut33showed strong anti-proliferation effects on liver cancer cell BEL7402，colon cancer cell HCT8，and gastric cancer cell SGC7901 at different concentrations，and all of them showed stronger than that of wild type rhIL-29. At a high concentration of the rhIL-29mut33，the inhibition ratios of the three tumor cells were （31.76±2.87）%，（22.47±0.26）%，and（34.41±0.40）%，respectively. The superior biological activities of rhIL-29mut33，especially the antitumor activity，make it have great potential applications in the drug industry.

Keywords：human interleukin-29，site-directed mutation，gene cloning，expression，antineoplastic activity

*通信作者：陳偉（1956—），男，江西宜豐人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事免疫學(xué)和生物制藥方面的研究。E-mail：chenwei@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210295024）。

收稿日期：2014-07-07

中圖分類號(hào)：Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）02—0185—07