鄒彎，魏玉潔，王德良，薛潔*，武運*，左俊偉

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(寧夏大學(xué)，寧夏 銀川，750021)

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葡萄酒貯存過程中氨基甲酸乙酯動力學(xué)反應(yīng)

鄒彎1，魏玉潔1，王德良2，薛潔2*，武運1*，左俊偉3

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 3(寧夏大學(xué)，寧夏 銀川，750021)

摘要為了更好地評價葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的潛在危害性，對貯存過程中氨基甲酸乙酯含量變化進行了研究，通過分析貯存溫度、初始尿素和瓜氨酸含量對貯存過程中氨基甲酸乙酯含量的影響，表明在貯存過程中葡萄酒中尿素和瓜氨酸的變化符合平衡反應(yīng)動力學(xué)模型，而氨基甲酸乙酯含量的變化呈現(xiàn)準(zhǔn)一級動力學(xué)反應(yīng)特征，基于研究結(jié)果，文章建立了預(yù)測貯存過程中氨基甲酸乙酯含量的方程。

關(guān)鍵詞葡萄酒；氨基甲酸乙酯-；動力學(xué)反應(yīng)；尿素；溫度；瓜氨酸

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,簡稱EC)，又稱Urethane、聚脲乙烷，是煙草葉的天然成分，葡萄酒、白蘭地、黃酒、白酒、面包、奶酪等發(fā)酵的食品和飲料的伴隨產(chǎn)物[1-3]。1943 年，EC已被證實為致癌物質(zhì)[4-6],具有遺傳毒性，在動物實驗中證據(jù)充分，它可以導(dǎo)致肺癌、淋巴癌等疾病[7-8]。EC也是人體可能的致癌對象。1987年,國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將EC歸為2B類致癌物[9]。2002年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將EC列為重點監(jiān)測物質(zhì)，并規(guī)定其含量不得超過20 μg/L[10]。2007年，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)再次對EC進行評估，認(rèn)為經(jīng)食物和飲料酒攝入的總量可能對人體健康造成潛在危險，并將其列為2A級別的致癌物質(zhì)[11]。

葡萄酒中形成EC的前體物質(zhì)有尿素、瓜氨酸、氫氰酸、N-氨基甲?；衔锏?。研究表明，高溫、乙醇、尿素和瓜氨酸、發(fā)酵時間等條件都對EC的形成有顯著作用[12-15]。同時UTHURRY等研究也發(fā)現(xiàn)，剛釀造的葡萄酒中EC含量一般在1～10 μg/L，但貯存條件和時間會影響消費時葡萄酒中的EC含量；高溫、高含量的乙醇、尿素和瓜氨酸都對EC的形成有顯著作用，因此要確保葡萄酒貯存一定時間后EC含量仍在一個合理的水平，首先要建立能夠準(zhǔn)確預(yù)測貯存期間葡萄酒EC含量的方法。目前經(jīng)典的預(yù)測潛在EC含量的方法是將葡萄酒在80 ℃下加熱保持24 h，但該方法得到的EC含量數(shù)值偏大，并不能真正反映貯存期間EC實際濃度的變化趨勢[16-17]，因此建立一種葡萄酒貯存期間EC濃度的預(yù)測模型具有重要意義。本研究在探討葡萄酒EC動力學(xué)反應(yīng)規(guī)律的基礎(chǔ)上，建立了預(yù)測貯存過程中EC含量的方程，為揭示葡萄酒貯存期間EC的變化機理提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1葡萄酒樣品制備

參考付方圓等人的方法[18]。

1.1.2儀器與設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國PerkinElmer公司，安捷倫DB-FFAP毛細管色譜柱(60 m×0.25 μm×0.25 μm)；strata FL-PR Florisil固相萃取柱，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3主要化學(xué)試劑

氨基甲酸乙酯(EC)(純度>99%)、內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丙酯(nPC)(純度>98%)：Sigma公司，二氯甲烷、尿素：分析純，丙酮、瓜氨酸：色譜純，百靈威公司。

1.2分析方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

10 mg/L的EC工作液：配置質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的EC儲備液(準(zhǔn)確稱取0.100 0 g EC于100 mL容量瓶中，甲醇定容)，吸取0.25 mL EC儲備液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容。

10 mg/L的nPC工作液：配置質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的nPC儲備液(準(zhǔn)確稱取0.100 0 g nPC于100 mL容量瓶中，甲醇定容)，吸取nPC儲備液0.25 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.2.2樣品前處理

酒樣的制備：吸取nPC內(nèi)標(biāo)工作液0.25 mL于25ml容量瓶，用酒樣定容，混勻，待用。

固相萃取柱的活化與洗脫：先取10 mL的正己烷，活化固相萃取柱，棄去流出液。再吸取0.5 mL制備好的酒樣，緩慢流過柱體至干，棄去流出液。再吸取2 mL的正己烷洗柱，棄去流出液。最后用10 mL二氯甲烷洗脫，并用頂空瓶接收，至洗脫液流干。

將頂空瓶中的洗脫液放入氮吹儀，進行氮吹，氮吹至0.5 mL。轉(zhuǎn)移氮吹液至進樣瓶，待測。

1.2.3色譜-質(zhì)譜條件

升溫程序：柱初始溫度60 ℃，保留5 min，以4 ℃/min升溫速率至150 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min升溫速率至222 ℃，保留2 min。

進樣口溫度：260 ℃；傳輸線溫度：240 ℃；載氣：氦氣(99.999%)；流速：1 mL/min；進樣量：1 μL。不分流進樣，2 min后，打開分流出口，分流流量30 mL/min 。

1.2.4樣品檢測

使用EC工作液分別用二氯甲烷制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L的EC溶液，加入內(nèi)標(biāo)，使其質(zhì)量濃度均為0.4 mg/L nPC。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

處理好的試樣，加入內(nèi)標(biāo)進樣分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出試樣中EC含量。

1.2.5瓜氨酸的測定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色譜法[19]。

1.2.6尿素的測定方法

采用高效液相-熒光檢測器法[20]。

1.2.7數(shù)據(jù)的處理

模型動力學(xué)參數(shù)的估計均采用origin9.0軟件對動力學(xué)方程進行非線性擬合獲得。

2結(jié)果與分析

2.1貯存溫度對葡萄酒中尿素含量的影響

在葡萄酒貯存的過程中，酒液中的尿素會與乙醇繼續(xù)反應(yīng)，所以隨著貯存時間的延長，尿素含量會降低。本實驗將初始尿素含量為5.1 mg/L葡萄酒和初始瓜氨酸含量為5.73 mg/L葡萄酒分4份分別放入15、20、25、30 ℃的貯存溫度下，跟蹤200 d的貯存過程中尿素和瓜氨酸的含量的變化，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，葡萄酒貯存期間，尿素含量呈對數(shù)下降變化趨勢，貯存初期下降速度非?？?，隨著時間的延長，下降速度逐漸減緩。同樣實驗中其他3個初始尿素含量不同的葡萄酒尿素的變化也呈現(xiàn)相同的趨勢，其含量與時間或含量的自然對數(shù)與時間均不呈線性關(guān)系，說明了貯存期間尿素的降解不符合一級反應(yīng)動力學(xué)的特點，這與ROBERTO等的報道不同[2]，可能是因為本研究貯存溫度較低，而且初始尿素含量較高的緣故。

圖1　葡萄酒貯存過程中尿素含量的動力學(xué)變化Fig.1　The dynamic change of urea concentrations in wines during storage

圖1顯示,隨著時間的延長，尿素含量是逐漸趨于平衡，因此參照HASNIP報道的平衡一級反應(yīng)方程：

(1)

式中：k1為尿素降解反應(yīng)的速率常數(shù)；k2為尿素再生成速率常數(shù)。

使用origin8.0軟件將貯存期間尿素含量與方程1進行擬合，固定[U]0值，擬合結(jié)果如表1所示。

從表1數(shù)據(jù)可以看出，初始尿素含量不同的葡萄酒在不同貯存溫度下擬合方程均達到了極顯著水平(P值均小于0.01)，說明擬合方程(1)可以反應(yīng)葡萄酒貯存期間尿素的變化特點。當(dāng)尿素初始質(zhì)量濃度為5.1 mg/L時，隨著貯存溫度的升高，反應(yīng)速率隨著增加，本實驗中溫度上升10 ℃，尿素反應(yīng)速度增加了1.8倍。

表1　不同指標(biāo)葡萄酒貯存過程中尿素反應(yīng)擬合動力學(xué)方程及參數(shù)

注：K1為尿素降解速率常數(shù)；K2為尿素合成速率常數(shù)；[u]t為t時間葡萄酒中尿素含量，而[u]0為初始尿素含量。

2.2貯存溫度對葡萄酒中EC含量的影響

由于尿素和瓜氨酸是合成葡萄酒中氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)，因此尿素和瓜氨酸含量的變化會引起EC的變化，不同溫度下隨著葡萄酒中尿素和瓜氨酸含量的降低，EC含量也呈現(xiàn)對數(shù)增加趨勢，如圖2所示。

圖2　貯存過程中葡萄酒中EC動力學(xué)變化趨勢Fig.2　The dynamic change of EC concentrations in wines during storage

貯存期間，葡萄酒中EC的變化與尿素和瓜氨酸的含量變化相反，先呈現(xiàn)快速增加，隨后緩慢增長的趨勢，溫度越高，葡萄酒中EC含量也會越高，貯存30 d的葡萄酒在30 ℃下樣品中的EC含量約為15 ℃的1.5～2倍；但是由于本實驗的貯存溫度均在30 ℃以下，從結(jié)果看樣品中的EC均未超過15 μg/L，說明了低溫貯存可以限制葡萄酒中EC的增加量。

2.3葡萄酒初始尿素含量對貯存期間氨基甲酸乙酯含量的影響

根據(jù)資料報道，葡萄酒中EC含量與尿素濃度間呈正比例關(guān)系。本研究跟蹤了初始尿素含量不同的葡萄酒貯存期間EC含量的變化，結(jié)果如圖3所示。

由圖3中EC的變化趨勢可知，無論初始尿素含量的高低，葡萄酒中的EC均呈現(xiàn)開始快速增長，隨后逐漸穩(wěn)定的趨勢。初始尿素含量越低，達到平衡所需要的時間越短，產(chǎn)生的EC含量也越低；初始尿素含量越高，貯存一段時間后EC的含量也越高。根據(jù)圖2中的數(shù)據(jù)，可求不同時間內(nèi)的EC變化量(d[EC]/dt)，結(jié)合圖1得到的d[urea]/dt，作圖得到一條直線，說明葡萄酒貯存期間EC的形成與尿素濃度的變化呈比例關(guān)系，直線的斜率即為由尿素形成的EC的速率常數(shù)Ku。同樣的方法作由瓜氨酸引起EC含量的變化圖，同樣得到一條直線，直線的斜率為不同溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)Kc值，結(jié)果表2所示。

圖3　不同尿素含量的葡萄酒貯存期間EC的變化趨勢圖Fig.3　Formation of EC with time in wines which have various urea concentrations

表2　不同溫度速率常數(shù)Ku(尿素形成EC)和Kc(瓜氨酸形成EC)

表2數(shù)據(jù)顯示，30 ℃時，Ku和Kc分別為0.002 4和0.000 4，與HASNIP報道的28 ℃ Ku=0.001 2和Kc=0.000 18基本接近。由反應(yīng)速率常數(shù)值可知，當(dāng)葡萄酒貯存溫度每升高10 ℃，由尿素產(chǎn)生的EC含量可增長1.5～2倍，根據(jù)Arrhenius方程，計算得到尿素轉(zhuǎn)化生成EC的活化能Eu=34.037 kJ/mol，瓜氨酸轉(zhuǎn)化生成EC的活化能Ec=66.019 kJ/mol。

2.4貯存溫度對葡萄酒中瓜氨酸含量變化的影響

瓜氨酸也是影響葡萄酒中EC含量另一個重要因素，本實驗對不同溫度下葡萄酒中瓜氨酸的含量進行了跟蹤分析，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，貯存期間葡萄酒中瓜氨酸含量呈現(xiàn)下降趨勢，貯存初期，下降速度很快，后期逐漸變緩，與尿素在貯存期間的變化趨勢基本一致，根據(jù)平衡反應(yīng)方程(1)對貯存期間瓜氨酸含量與時間進行擬合，擬合方程如表3。

圖4　葡萄酒貯存過程中瓜氨酸含量的動力學(xué)變化Fig.4　The dynamic change of citrulline concentrations in wines during storage

溫度/℃方程擬合相關(guān)系數(shù)(R2)K3K415[c]t=[c]0×0.02504+0.00757exp-(0.00757+0.02504)t0.00757+0.02504[]0.96890.007570.0250420[c]t=[c]0×0.02395+0.0145exp-(0.0145+0.02395)t0.0145+0.02395[]0.99060.01450.0239525[c]t=[c]0×0.02113+0.01827exp-(0.01827+0.02113)t0.01827+0.02113[]0.98490.018270.0211330[c]t=[c]0×0.01898+0.02728exp-(0.02728+0.01898)t0.02728+0.01898[]0.97310.027280.01898

注：K3為瓜氨酸降解速率常數(shù)；K4為瓜氨酸合成速率常數(shù)；[C]t為t時間葡萄酒中瓜氨酸含量，而[C]0為初始瓜氨酸含量，本實驗為5.73mg/L。

由實驗所測的K3可知，溫度影響瓜氨酸的降解速率，溫度每升高10倍，瓜氨酸的降解速率可提高1.5～2.5倍，大于溫度對尿素降解速率的影響。根據(jù)不同溫度下瓜氨酸的速率常數(shù)，可得到瓜氨酸降解反應(yīng)活化能為59.27 kJ/mol。

通過分析不同溫度下由瓜氨酸引起的EC含量的變化，發(fā)現(xiàn)瓜氨酸形成的EC與時間t之間也符合假一級反應(yīng)的特征，通過擬合，得到不同溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)，表3所示。

3討論

試驗數(shù)據(jù)表明，葡萄酒中EC的形成取決于貯存期間尿素和瓜氨酸含量的變化，假設(shè)葡萄酒中尿素和瓜氨酸是形成EC的兩條主要途徑，而且兩個反應(yīng)獨立而不相互影響，加上整個貯存期間，葡萄酒中的酒精度基本保持不變，則t時刻葡萄酒中EC含量可表達為：

(2)

根據(jù)該公式，如果需要推測葡萄酒在20℃貯存100天的EC含量，則該表達式可轉(zhuǎn)換為：

[EC]t=[EC]0+[EtOH](0.118[u]0+ 0.017 8[C]0)

根據(jù)研究數(shù)據(jù)本研究得到了預(yù)測葡萄酒貯存期間中EC含量的方程(2)，為了驗證試驗方程的準(zhǔn)確性，本研究在分別在18 ℃和23 ℃下分別貯存了一批紅葡萄酒和白葡萄酒，然后定期分析葡萄酒中的EC含量，將其與方程預(yù)測數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果顯示分析數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)基本吻合(圖5、圖6所示)。如在50天的紅葡萄酒18 ℃的分析數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)分別為3.82、3.75，23 ℃分析數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)分別為5.75、5.50；50天的白葡萄18 ℃的分析數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)分別3.58、3.30，在23 ℃的分析數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)分別為4.30、4.22。但是由于本研究只有1年的分析數(shù)據(jù)，所以隨著貯存時間的延長，預(yù)測方程是否準(zhǔn)確還需要進一步的驗證。

圖5　紅葡萄酒預(yù)存期間不同溫度下EC實測數(shù)據(jù)(-×-)與預(yù)測數(shù)據(jù)(-▲-)對比Fig.5　Formation of EC with time observed in red wine(-×-) and the corresponding formation predicted by equation4(-▲-) at various temperatures

圖6　白葡萄酒預(yù)存期間不同溫度下EC分析數(shù)據(jù)(-×-)和方程預(yù)測數(shù)據(jù)(-▲-)對比Fig.6　Formation of EC with time observed in white wine(-×-) and the corresponding formation predicted by equation4(-▲-) at various temperatures

4結(jié)果

溫度上升10 ℃，尿素反應(yīng)速度增加了1.8倍；在同一溫度下，葡萄酒中初始尿素含量越高，反應(yīng)速率也越高。葡萄酒初始尿素含量為15.1 mg/L，在15、20、25 ℃三個溫度下的速率常數(shù)是尿素含量5.0 mg/L的2.3倍、2倍、1.7倍。

本實驗建立了預(yù)測貯存過程中氨基甲酸乙酯含量的方程，可以推測葡萄酒在任意溫度儲存任意天數(shù)的EC含量。

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Ethyl carbamate production kinetics during wine storage

ZOU Wan1, WEI Yu-jie1, WANG De-liang2,XUE Jie2*, WU Yun1*, ZUO Jun-wei2

1(Department of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agriculture University, Urumchi 830052,China) 2(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 10015, China) 3(Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

ABSTRACTThe kinetics of EC formation during wine storage was investigated to evaluate the potential risk of ethyl carbamate (EC) formation in wine. The EC, urea and citrulline concentration at different storage temperatures were monitored. We found that temperature and initial urea content had significant effects on EC formation. The decay of urea and citrulline fit a first-order reaction approaching equilibrium. Based on these results, we constructed an equation to forecast the content of ethyl carbamate during wine storage.

Key wordswine; ethyl carbamate(EC); dynamic reaction; urea; temperature; citrulline

收稿日期：2015-11-19，改回日期：2015-12-28

基金項目：新疆自治區(qū)科技計劃項目(201431113)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604007

第一作者：碩士研究生(武運，薛潔為共同通訊作者, E-mail：764630324@qq.com;E-mail：825728388@qq.com)。