韋琴，樂薇，呂凱波，楊文婷，朱文婷

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢，430065)

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板栗殼原花青素的提取及體外抑菌作用研究

韋琴*，樂薇，呂凱波，楊文婷，朱文婷

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢，430065)

摘要采用超聲波提取法對(duì)板栗殼原花青素(procyanidins from chestnut shells, CSPCs)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，在單因素的基礎(chǔ)上以提取溶劑體積比、超聲波提取時(shí)間、料液比為考察因素，以原花青素的得率(mg/g)為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝；采用濾紙片法測(cè)定抑菌圈大小，采用試管二倍梯度稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(mini muminhibition concentrations，MIC)。結(jié)果表明：板栗殼原花青素最佳提取工藝條件是以乙醇為最佳提取溶劑，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，料液比為1∶30(g∶mL)，超聲時(shí)間為50 min；板栗殼原花青素對(duì)真菌類的白色念珠菌和啤酒酵母菌均有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，對(duì)大腸桿菌無抑菌作用，抑菌效果由大到小依次為：啤酒酵母菌>金黃色葡萄球菌>白色念珠菌，MIC依次為0.120、0.958、3.831 mg/mL。

關(guān)鍵詞板栗殼；原花青素；提??；抑菌活性

原花青素是一類由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素或沒食子酸經(jīng)C4-C6或C4-C8鍵縮合而成的聚多酚類物質(zhì)[1]。原花青素在自然界廣泛分布，種類繁多，能有效清除體內(nèi)自由基，具有抗氧化、抗輻射、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理活性。板栗，是一類山毛櫸科植物，人們習(xí)慣稱其為栗子，屬于落葉喬木種類。板栗在我國(guó)的種植時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3萬年之久，其栽植面積和生產(chǎn)量在近幾年都訊速增長(zhǎng)，每年的產(chǎn)量均超過100萬t。板栗殼一直以來大部分仍然采用焚燒和自然腐敗的方法處理后遺棄，如果充分利用這些資源則可以產(chǎn)生更多經(jīng)濟(jì)效益。

本研究以板栗殼為原料，采用超聲波提取法對(duì)板栗殼原花青素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，并探討了板栗殼原花青素的抑菌作用。

1材料與方法

1.1材料與儀器

板栗，湖北羅田；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品(含量>98%)，天津尖峰天然產(chǎn)物開發(fā)公司；無水乙醇、 甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、濃HCl、硫酸鐵銨、NaOH、異丙醇、均為分析純；AB-8大孔樹脂，天津市海光化工有限公司；供試菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、啤酒酵母菌、白色念珠菌,均由武漢工商學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

XW-80A微型旋渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器，超聲頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司；DG120型四兩裝中藥材粉碎機(jī)，浙江省瑞安市春海藥材器械廠； HH系列恒溫水浴鍋，江蘇金壇中大儀器廠；TDZ5-WS湘麓離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司；722E型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HL-2恒流泵，BSZ-160型自動(dòng)部分收集器，上海青蒲滬西儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1板栗殼原花青素的提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1樣品預(yù)處理

新鮮板栗取板栗殼在40 ℃烘箱中48 h烘干，粉碎，過40目篩，用正己烷浸泡并在溫室搖床(150 r/min)中脫脂24 h，真空過濾，濾渣置于通風(fēng)櫥24 h以去除殘留的正己烷，得板栗殼粉末，干燥容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[2-3]

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用60%的乙醇定容至2 mL容量瓶中，各取1.0 mL，分別加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液(體積比95∶5)和0.2 mL 2%硫酸高鐵銨溶液，搖勻后沸水浴加熱40 min，顯色后立即使用冰水冷卻，快速用可見分光光度計(jì)于550 nm處比色測(cè)定，繪制原花青素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.860 3x-0.001 5(x為原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，表明原花青素對(duì)照品吸光度與原花青素濃度之間具有良好的線性關(guān)系。

1.2.1.3板栗殼原花青素提取的單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取不同的提取溶劑、溶劑的濃度、料液比、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，具體方法如下：

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過板栗殼粉末1.0 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)60%甲醇、60%乙醇、乙酸乙酯、蒸餾水，在料液比為1∶40(g∶mL)，超聲時(shí)間為30 min的條件下提取板栗殼原花青素，3 000 r/min離心10 min，上清液定容到100 mL，取1 mL，按照1.2.1.2顯色并測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到樣品液中原花青素的濃度。根據(jù)公式1可計(jì)算原花青素得率?？疾觳煌奶崛∪軇?duì)原花青素得率的影響。

原花青素得率/(mg·g-1)=

(1)

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過板栗殼粉末1.0 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、55%、60%、65%、70%的提取溶劑，在料液比為1∶40，超聲時(shí)間為30 min的條件下提取板栗殼原花青素，3 000 r/min離心10 min，上清液定容到100 mL，后續(xù)步驟同上?？疾焯崛∪軇┑捏w積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響。

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過板栗殼粉末1.0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的提取溶劑，料液比(g∶mL)分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，超聲30 min，3 000 r/min離心10 min，上清液定容到100 mL，后續(xù)步驟同上?？疾炝弦罕葘?duì)原花青素得率的影響。

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理過板栗殼粉末1.0 g，加入體積百分比為60%的提取溶劑，料液比為1∶40，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60，3 000 r/min離心10 min，上清液定容到100 mL，后續(xù)步驟同上?？疾斐晻r(shí)間對(duì)原花青素得率的影響。

1.2.1.4板栗殼原花青素的正交試驗(yàn)優(yōu)化

按照單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

1.2.1.5驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)選定的最佳提取條件進(jìn)行提取，做5組平行試驗(yàn)，取平均值作為最佳提取條件下板栗殼原花青素的得率。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.2板栗殼原花青素粗提液的純化與凍干粉純度測(cè)定

將預(yù)先處理好的AB-8大孔吸附樹脂濕法裝柱并平衡靜置12 h后，將最佳實(shí)驗(yàn)條件下提取的原花青素粗提液以2 mL/min流速上柱吸附，吸附平衡后用4倍柱體積的蒸餾水沖洗去除水溶性色素和多糖等雜質(zhì)，再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液以1 mL/min流速洗脫，收集洗脫液[4]。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集的洗脫液進(jìn)行濃縮，將濃縮液于真空冷凍干燥，除去殘留乙醇和水分，制成板栗殼原花青素凍干粉，放入冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取板栗殼原花青素凍干粉10 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中。搖勻后取1 mL，按照1.2.1.2顯色并測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到原花青素的濃度。做3次平行試驗(yàn)，取平均值。根據(jù)公式2計(jì)算凍干粉中原花青素的純度。

原花青素純度/%=

(2)

1.2.3板栗殼原花青素的體外抑菌試驗(yàn)

1.2.3.1培養(yǎng)基的制備

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，固體培養(yǎng)基另加瓊脂20 g。加熱溶解，調(diào)pH 7.0～7.2，分裝，121 ℃滅菌20 min，用于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌[5]。豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基：稱新鮮黃豆芽100 g，放入大燒杯中，加水1 L，煮沸約30 min,用6層紗布過濾棄掉濾渣，加入葡萄糖50 g，再加水補(bǔ)足至原量，pH自然，融化后分裝，121 ℃滅菌20 min，用于培養(yǎng)啤酒酵母菌。察氏培養(yǎng)基：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 L，固體培養(yǎng)基另加瓊脂20 g，自然pH，加熱溶解分裝后，121 ℃滅菌20 min，用于培養(yǎng)白色念珠菌。

1.2.3.2菌種的活化及菌懸液的制備

在超凈工作臺(tái)上將供試菌種接種到各自的液體培養(yǎng)基上活化2次，每次活化細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)36 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h。然后用接種環(huán)蘸取活化的菌種劃斜面，待斜面長(zhǎng)出后放入4 ℃冰箱備用，使用前用接種環(huán)挑取斜面種到無菌生理鹽水中，制成菌體濃度為105～106個(gè)/mL的菌懸液，用振蕩器搖勻，備用。

1.2.3.3濾紙片法測(cè)定板栗殼原花青素的抑菌作用

用打孔器制好直徑6 mm濾紙片若干放入干燥培養(yǎng)皿中滅菌，放入干燥箱中干燥備用。將事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基融化，在無菌操作臺(tái)上倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿約20 mL，待皿中培養(yǎng)基凝固冷卻后，加入0.2 mL已制備好的菌懸液并涂布均勻。用鑷子夾取干燥后的濾紙片分別蘸取板栗殼原花青素凍干粉配置的不同濃度的水溶液、無菌水、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液后放入涂布后的平板上，每皿放入5片濾紙片，其中3片為浸泡原花青素純化液的濾紙片(3個(gè)平行試驗(yàn))，1片為浸泡無菌水的濾紙片，作為陰性對(duì)照，另1片為浸泡75%乙醇溶液的濾紙片，作為細(xì)菌的陽性對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)3皿，測(cè)量結(jié)果取平均值。將處理好的培養(yǎng)皿倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)，真菌28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑(mm)，結(jié)果取平均值[6]。

1.2.3.4試管二倍梯度稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)[7-8]

取若干試管洗凈滅菌干燥待用，對(duì)5種供試菌分別進(jìn)行研究。將11支試管編號(hào)，從第2號(hào)管開始每管加入5 mL無菌去離子水，在第1號(hào)管中加入純化后的濃度為7.662 mg/g的板栗殼原花青素溶液10 mL，從第1號(hào)管開始取5 mL樣品溶液到下一管中并搖勻，依次稀釋，最后一管取5 mL溶液棄掉。然后每管中加入5 mL液體雙料培養(yǎng)基，接種0.5 mL菌液，并搖勻。以5.5 mL無菌去離子水加5 mL雙料培養(yǎng)基為0號(hào)陰性對(duì)照，以5.5 mL無菌去離子水加5 mL雙料培養(yǎng)基接種0.5 mL菌液為12號(hào)陽性對(duì)照。將處理好的樣品放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，觀察試管中液體渾濁情況并測(cè)定各樣品在600 nm處吸光度值，當(dāng)某管不再發(fā)生渾濁現(xiàn)象且吸光度值接近于空白對(duì)照時(shí)該管原花青素濃度即為MIC。

2結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取溶劑的確定

不同提取溶劑對(duì)板栗殼原花青素得率的影響見圖1。結(jié)果表明，提取效果最好的是體積分?jǐn)?shù)60%甲醇和60%乙醇，60%的甲醇略高。由于考慮到甲醇毒性比乙醇大，且兩者在60%的濃度下提取的得率比較接近，考慮到試驗(yàn)安全性和成本使用情況，選用乙醇作為最佳提取溶劑。

圖1　不同提取溶劑對(duì)板栗殼原花青素得率的影響Fig.1　Effect of solvent on the CSPCs yield

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響見圖2。結(jié)果表明，板栗殼原花青素的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)最大值60%時(shí)，原花青素得率最大，隨后降低。乙醇體積分?jǐn)?shù)過高反而不利于原花青素的提取，因此選擇60%乙醇為最佳提取濃度。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)板栗殼原花青素得率的影響Fig.2　Effect of ethanol percentage on the CSPCs yield

2.1.3料液比對(duì)原花青素得率的影響

料液比對(duì)原花青素得率的影響見圖3。

圖3　料液比對(duì)板栗殼原花青素得率的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the CSPCs yield

結(jié)果表明，一般來說隨著溶劑體積的增加，原花青素得率也相應(yīng)增加。當(dāng)料液比大于1∶40時(shí)，原花青素的得率不再增加，反而有所降低，溶劑使用量增大會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的產(chǎn)生，影響原花青素的提取，同時(shí)考慮到成本使用情況，選擇1∶40為最佳料液比。

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響見圖4。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加原花青素得率增加，在40 min時(shí)原花青素的溶出量最大，提取效果最好。之后再延長(zhǎng)提取時(shí)間，原花青素得率不僅無明顯提高，反而下降，可能是超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)加速了原花青素的氧化分解。因此，選擇最佳超聲時(shí)間為40 min。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)板栗殼原花青素得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic extraction time on the CSPCs yield

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

以原花青素的得率為參考指標(biāo)，由表2可知各因素對(duì)板栗殼原花青素得率的影響大小依次為：A>C>B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>料液比。表2由表3方差分析來看，A(乙醇體積分?jǐn)?shù))對(duì)得率影響顯著，B(料液比)和C(超聲時(shí)間)影響不顯著。從直觀分析來看，板栗殼原花青素的最佳提取條件為A3B1C3，即乙醇濃度65%、料液比1∶30、超聲時(shí)間50 min。

表2　正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

表3　正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00，*顯著 。

2.3驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在最佳提取條件下，做5次平行試驗(yàn)得到原花青素得率分別為36.67、35.86、37.02、35.39、36.44 mg/g。平均值為36.27 mg/g，RSD值為1.79%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.4純化所得板栗殼原花青素凍干粉純度的測(cè)定

結(jié)果表明，平行試驗(yàn)3次所得原花青素純度分別為78.17%、76.42%、75.26%，純化所得凍干粉純度取平均值為76.62%，RSD值為1.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明該實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.5濾紙片法測(cè)定板栗殼原花青素的抑菌作用

由表4可知，對(duì)照組中蒸餾水對(duì)各供試菌無抑菌效果，75%乙醇溶液對(duì)細(xì)菌類金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，對(duì)真菌類的白色念珠菌和啤酒酵母菌無抑菌作用。質(zhì)量濃度在3.831～11.493 mg/mL的板栗殼原花青素對(duì)真菌類的白色念珠菌和啤酒酵母菌均有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，對(duì)大腸桿菌無抑菌作用?？傮w來說，板栗殼原花青素隨著質(zhì)量濃度的提高，對(duì)金黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌和白色念珠菌抑菌圈增大，抑菌作用增強(qiáng)，抑菌效果和原花青素濃度呈一定正相關(guān)。質(zhì)量濃度為7.662 mg/mL及以上的原花青素溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌和白色念珠菌的抑制效果均要強(qiáng)于75%乙醇溶液。

表4　抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果比較

注：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，抑菌圈直徑包括濾紙片直徑6.00 mm。

質(zhì)量濃度為11.493 mg/mL的CSPCs對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果如圖5所示。

綜合各因素判斷板栗殼原花青素對(duì)4種供試菌的抑菌效果次序?yàn)椋浩【平湍妇?金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>大腸桿菌。

1、2、3-11.49 mg/mL的CSPCs3次平行試驗(yàn)；4-蒸餾水；5-75%乙醇圖5　板栗殼原花青素抑制金黃色葡萄球菌效果照片F(xiàn)ig.5　Photo of CSPCs inhibit Staphylococcus aureus

2.6板栗殼原花青素MIC的測(cè)定

由表5可知，質(zhì)量濃度在0.007～7.662 mg/mL的板栗殼原花青素對(duì)大腸桿菌無明顯抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、啤酒酵母菌的最小抑菌濃度依次為0.958、3.831、0.120 mg/mL?？梢姲謇鯕ぴㄇ嗨貙?duì)4種供試菌的抑菌效果次序?yàn)椋浩【平湍妇?金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>大腸桿菌。

表5　MIC的測(cè)定結(jié)果

注：“-”表示無菌生長(zhǎng)，“+”表示少量菌生長(zhǎng)，“++”表示有菌大量生長(zhǎng)。

3結(jié)論

(1)正交試驗(yàn)優(yōu)化法中板栗殼原花青素的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、超聲時(shí)間50 min、料液比1∶30。

(2)本試驗(yàn)中用于抑菌研究的板栗殼原花青素是經(jīng)過AB-8大孔樹脂吸附純化后的產(chǎn)物，濃縮后經(jīng)過真空冷凍，除去了乙醇和水分，最終形成了干燥粉。干燥粉中除去了乙醇的殘留對(duì)抑菌作用的影響，使得試驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

(3)抑菌作用研究顯示，板栗殼原花青素在0.007～11.493 mg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)革蘭氏陰性桿菌類的大腸桿菌無抑菌作用，對(duì)革蘭氏陽性菌類的金黃色葡萄球菌有一定的抑菌效果，MIC為0.958 mg/mL，對(duì)真菌類的白色念珠菌和啤酒酵母菌也均有抑菌效果，MIC分別為3.831 mg/mL和0.120 mg/mL。參考文獻(xiàn)[9]研究了葡萄皮渣中原花青素的抑菌作用，其中提及在3～8 mg/mL內(nèi)葡萄皮渣中原花青素對(duì)革蘭氏陰性桿菌中的大腸桿菌無抑菌作用，對(duì)革蘭氏陽性菌類的金黃色葡萄球菌有抑菌作用；參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道了葡萄籽原花青素對(duì)真菌類的白色念珠菌有抑制作用，這些報(bào)道與本研究中板栗殼原花青素的抑菌性是有一致性的，說明板栗殼原花青素可以作為對(duì)抗革蘭氏陽性球菌和對(duì)抗真菌類的白色念珠菌的一種潛在新藥。本研究只是對(duì)板栗殼原花青素的提取和抑菌活性進(jìn)行了初步報(bào)道，關(guān)于其抑菌的確切機(jī)制還有待深入的研究和探討。

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Study on extracting technology by orthogonal design and antibacterial activity of procyanidins from chestnut shells

WEI Qin*， YUE Wei， LYU Kai-bo， YANG Wen-ting， ZHU Wen-ting

(Environmental and Biological Engineering College,Wuhan Technology and Bussiness University,Wuhan 430065,China)

ABSTRACTThis paper reported the optimization of extraction process of procyanidins from chestnut shells, CSPCs by orthogonal design. On the basis of single-factor experiments, with procyanidins yield (mg/g) as an index，three extraction factors including ethanol percentage，solid-liquid ratio and ultrasonic extraction time were optimized. At the same time, mini muminhibition concentrations，MIC were determined by filter paper method and tube double dilution method. The optimum process conditions were ethanol concentration of 65%, solid-liquid ratio of 1∶30 (g∶mL), and ultrasonic extraction time of 50 min. The CSPCs had a certain inhibitory effect on Staphylococcus aureus, Monilia albican and Saccharomyces cerevisiae, but had no inhibitory effect on Escherichia coli. The inhibitory effect is from strong to weak in the order: Saccharomyces cerevisiae>Staphylococcus aureus>>Monilia albican. Its MIC was 0.120 mg/mL, 0.958 mg/mL and 3.831 mg/mL, respectively.

Key wordschestnut shell; procyanidins; extraction; antibacterial activity

收稿日期：2015-09-06，改回日期：2015-10-27

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No. B2015336);武漢工商學(xué)院校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目(No. A2014022)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604039

第一作者：碩士,講師(本文通訊作者，E-mail:53471348@qq.com)。