宋燁威，金紅娜，徐潔，謝宏*

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 2(蘇州禾研生物技術有限公司，江蘇 蘇州，215600)

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昆侖雪菊中黃酮類化合物的提取分離及抗氧化活性評價

宋燁威1，金紅娜1，徐潔2，謝宏1*

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 2(蘇州禾研生物技術有限公司，江蘇 蘇州，215600)

摘要通過正交試驗優(yōu)化提取條件，利用大孔樹脂、反相硅膠等柱層析手段對昆侖雪菊的粗提液進行分離，并采用DPPH法對各分離部位進行抗氧化活性評價。結果表明：正交優(yōu)化分析得到最優(yōu)提取條件是料液比為1∶20(g∶mL)，用體積分數(shù)70%的乙醇浸泡、提取昆侖雪菊2次，溫度為80℃，時間為1 h，得到最佳昆侖雪菊總黃酮提取率為9.92%；從粗提物中分離得到1個單體化合物，采用核磁共振(NMR)和電噴霧質譜(ESI-MS)鑒定其化學結構為金雞查爾酮；DPPH活性測定結果表明此化合物的抗氧化活性強于陽性對照蘆丁，其IC50為10.21 μg/mL。

關鍵詞昆侖雪菊；提取；分離鑒定；抗氧化活性

昆侖雪菊又名兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，是菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)一年生草本植物，為新疆特有植物，是目前新疆唯一與雪蓮齊名、具有獨特功效的稀有高寒植物，主要分布在新疆和田地區(qū)海拔高度3 200 m左右的昆侖山區(qū)北麓，僅在每年8月綻放一次，花期短暫，且生長面積小，產(chǎn)量極低，因而彌足珍貴[1-2]。它是集養(yǎng)生、保健和藥材為一身的天然植物，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振及瘡癤腫毒。昆侖雪菊富含黃酮、揮發(fā)油、皂苷、氨基酸等生物活性成分[4]，是具有廣闊前景和研究價值的新品種[4-5]。目前，雪菊的研究多集中于黃酮類化合物的提取及含量測定，對分離純化、結構鑒定等方面的研究相對較少。趙軍等[6]采用大孔樹脂、反相色譜柱等純化，從雪菊中分離得到7個黃酮類化合物。TERESA DIAS[7]利用HPLC-UV、HPLC-MS、硅膠柱色譜等技術得到16種黃酮類化合物，體內大鼠活性實驗鑒定結果表明，黃酮類化合物對其具有降血糖作用。

本研究采用正交試驗優(yōu)化昆侖雪菊總黃酮化合物的提取工藝，并以抗氧化活性為指標，采用活性追蹤方法，對粗提物進行分離純化得到單體化合物，采用NMR和ESI-MS鑒定其化學結構，采用1,1-二苯基-2-苦基肼自由基清除法(DPPH法)對化合物進行抗氧化活性評價。

1材料與方法

1.1材料與試劑

昆侖雪菊(北京林鴻茂茶葉有限公司)；乙醇、NaOH、濃HCl、醋酸鉀、Al(NO3)3、濃H2SO4均為分析純；甲醇為色譜純；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、蘆丁標準品購于Sigma公司；D101大孔樹脂，反相硅膠C18。

1.2主要儀器與設備

電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，UV-2700紫外分光光度計(島津儀器有限公司)，真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，旋轉蒸發(fā)器、中壓制備(BUCHI)，恒溫磁力攪拌水浴鍋(常州邁科諾儀器有限公司)，超純水器(Millipore)，離心機(eppendorf)，高效液相色譜儀(Agilent 1260)，液質聯(lián)用(Agilent 6100)，核磁共振儀(Bruker 400 MHz)。

1.3樣品的提取

采用溶劑提取法提取昆侖雪菊中黃酮類化合物，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間進行4因素3水平正交試驗，確定總黃酮最佳的提取工藝，因素水平見表1。每組實驗稱取10 g干燥的昆侖雪菊，分別加入一定濃度、體積的乙醇溶劑，設置溫度，提取2次，將提取液濃縮、干燥，備用。

表1　正交實驗法優(yōu)化樣品的提取

1.4總黃酮含量測定

1.4.1蘆丁標準曲線的繪制

精密吸取蘆丁對照品儲備液(0.2 mg/mL)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，分別依次加入100 g/L的Al(NO3)3、9.8 g/L的乙酸鉀各1.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置1 h。以70%乙醇為空白，在415 nm下測定吸光值。以蘆丁的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。得到線性回歸方程y=28.221x+0.036 7(R2=0.999 4)，表明蘆丁標準液的質量濃度在4.0～24.0 μg/mL內，吸光值與濃度的線性關系良好。

1.4.2粗提物中總黃酮含量的測定

精密稱取適量的樣品粗提物粉末，置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度。作為樣品試液。準確吸取1.0 mL樣品溶液置于50 mL容量瓶，分別加入100 g/L的Al(NO3)3、9.8 g/L的乙酸鉀各1.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置1 h，以空白試液作為參比，按1.4.1中方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算得到粗提物中總黃酮的含量。

(1)

式中：c，根據(jù)蘆丁標準曲線得質量濃度；V，樣品配制的體積；D，樣品稀釋倍數(shù)；m，稱量樣品的質量；M1，樣品提取物總質量；M2，提取用的樣品雪菊的質量。

1.5黃酮類化合物分離純化

1.5.1大孔樹脂分離昆侖雪菊中黃酮類化合物

稱取適量的昆侖雪菊，采取1.3中優(yōu)化提取條件提取黃酮類化合物，濃縮得到提取液。將提取液過濾后用D101大孔樹脂柱層析進行分離，分別采用30%、60%、90%乙醇溶液進行洗脫，根據(jù)液相在線檢測結果合并洗脫液，濃縮并檢測各部位DPPH抗氧化活性，根據(jù)其活性繼續(xù)追蹤分離。

1.5.2中壓制備分離純化昆侖雪菊中黃酮類化合物

對1.5.1中DPPH抗氧化活性最高的部位進行進一步的分離純化。采用C18反相硅膠柱層析，用25%乙醇等度洗脫，液相在線檢測，分離得到化合物，并檢測化合物的DPPH抗氧化活性。

1.6DPPH抗氧化活性檢測

DPPH溶液的配制：精確稱取5.00mgDPPH置于100mL容量瓶中，用75%乙醇溶解并定容，得到濃度為0.05mg/mL的DPPH標準儲備液，避光放置，備用。

樣品溶液的配制：稱取適量的樣品置于100mL容量瓶中，用75%乙醇溶解并定容，得到樣品溶液，避光放置，備用。

測定方法：精密吸取2.0mLDPPH溶液和2.0mL樣品溶液于5mL離心管中，搖勻后避光靜置30min，在517nm處測吸光值AI；精密吸取2.0mL樣品和2.0mL75%乙醇，搖勻后避光靜置30min，在517nm處測吸光值AJ；精密吸取2.0mLDPPH溶液和2.0mL75%乙醇，搖勻后避光靜置30min，在517nm處測吸光值AC。每個樣品重復3次實驗，計算DPPH自由基清除率。采用Excel2007和SPSS16.0統(tǒng)計軟件計算半抑制濃度IC50。

(2)

2結果與分析

2.1提取條件優(yōu)化結果

正交試驗結果見表2，4個影響因素對實驗結果的影響順序是：料液比(C)>提取溫度(B)>乙醇濃度(A)>提取時間(D)。正交試驗結果最佳組合為：C3B2A1D1，即：70%乙醇浸泡昆侖雪菊，料液比1∶30(g∶mL)，提取溫度為80 ℃，時間為1 h。但考慮經(jīng)濟成本，提取條件優(yōu)化為：70%乙醇浸泡昆侖雪菊，料液比1∶20，提取溫度為80 ℃，時間為1 h，提取2次，總黃酮含量為9.92%，采取此方法對提取昆侖雪菊中黃酮類化合物進行提取。

表2　昆侖雪菊的提取條件優(yōu)化結果

2.2DPPH抗氧化活性檢測

如表3所示，昆侖雪菊粗提物的清除自由基能力優(yōu)于陽性對照蘆丁，說明雪菊具有很好的抗氧化活性，值得深入研究。采用D101對粗提物進行梯度洗脫，并檢測各洗脫部位的活性，實驗結果顯示，60%乙醇洗脫部位的活性明顯優(yōu)于其他部位，說明這個部位可能含有抗氧化活性較好的化合物。因此將此部位用中壓繼續(xù)分離，尋找活性單體。

中壓分離得到1個單體化合物K1，液相譜圖如圖1所示，檢測其DPPH活性，IC50為10.21 μg/mL，顯著優(yōu)于陽性對照蘆丁，說明K1具有很強的抗氧化活性。液相檢測可見60%洗脫部位有較多化合物，后續(xù)實驗將繼續(xù)分離，檢測活性，分離更多活性較好的單體。

表3　昆侖雪菊各個分離部位的IC50

圖1　K1的HPLC色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of K1

2.3化合物的結構解析

K1化合物：橙紅色粉末；易溶于甲醇；熔點186～189 ℃；10%濃硫酸乙醇顯色為紅色；ESI-MS m/z 2891H-NMR (CD3OD，400 MHz)δ：7.65(1H，d，J=20 Hz，H-β)，7.67 (1H，d，J=8 Hz，H-6′)，7.65(1H，d，J=20 Hz，H-α)，7.27(1H，d，J=2 Hz，H-2)，7.19(1H，dd，J=8，2 Hz，H-6)，6.80(1H，d，J=8 Hz，H-5)，6.42(1H，d，J=8 Hz，H-5′)；13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ：191.97(C=O)，153.51(C-2′)，152.54(C-4′)，148.84 (C-4)，145.60(C-3)，144.60 (C-β)，132.42(C-3′)，126.24 (C-1)，122.25 (C-6)，122.45 (C-6′)，117.42 (C-α)，113.36 (C-1′)，115.75 (C-5)，115.79 (C-2)，107.64(C-5′)與文獻[8]報道基本一致，因此鑒定該化合物為金雞查爾酮(英文：Okanin)。NMR譜圖見圖2和圖3，金雞查爾酮的結構式如圖4所示。

圖2　K113C-NMR譜Fig.2　13C-NMR spectrum of K1

圖3　K11H-NMR 譜Fig.3　1H-NMR spectrum of K1

圖4　金雞查爾酮結構Fig.4　Okanin structure

3結論

黃酮類化合物有多種結構類型，查爾酮是其中重要的一種，存在于多種天然植物中，是植物體內合成黃酮的前體。由于查爾酮可結合不同的受體，因此具有廣泛的生物活性，本文主要研究其抗氧化活性。

本研究通過正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間這4個因素對昆侖雪菊總黃酮提取率的影響，利用正交優(yōu)化分析得到提取條件為料液比1∶20(g∶mL)、70%乙醇浸泡昆侖雪菊，提取溫度為80 ℃，提取時間為1 h，在此條件下提取2次，實驗結果得到雪菊總黃酮提取率為9.92%。將粗提物通過D101大孔樹脂進行梯度洗脫，利用DPPH法評價了各個分離部位提取物的抗氧化活性，并使用反相硅膠C18對活性最好的60%乙醇洗脫部位進行分離純化，得到1個單體化合物，通過ESI-MS和NMR等手段確定該單體化合物為金雞查爾酮，測定其IC50為10.21 μg/mL，遠低于陽性對照蘆丁的IC50值60.58 μg/mL，說明金雞查爾酮具有很強的抗氧化活性，為深入分析其活性以及進一步開發(fā)昆侖雪菊的營養(yǎng)健康功能提供了理論基礎。

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Isolation and identification of the flavonoids compounds fromCoreopsistinctoriaNutt. and evaluation of their antioxidant activities

SONG Ye-wei1, JIN Hong-na1, XU Jie2, XIE Hong1*

1(College of FoodScience,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China) 2(Suzhou Herb-Res Biotechnology Co.,Ltd,Suzhou 215600,China)

ABSTRACTThe total flavonoids were extracted from Coreopsis tinctoria Nutt. using the orthogonal experiment to optimize the extraction conditions, using macroporous resin and reverse phase silica gel column chromatography to separate crude extract, and using a method of DPPH to evaluate the antioxidant activity of each separate part. The results show that the optimum extraction conditions is using 70% ethanol as the extraction solvent for Coreopsis tinctoria Nutt., material liquid ratio of 1∶20, extracting twice at 80 ℃, extracting 1 h each time, the total flavonoids extraction rate is 9.92%; a single compound named Okanin was isolated from the crude extract, and its structure was identified by nuclear magnetic resonance (NMR) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). DPPH activity test results show that the antioxidant activity of the compound is better than that of the positive control Rutin, whose IC50is 10.21 μg/mL.

Key wordsCoreopsis tinctoria Nutt.; extraction; structure identification; antioxidant activity

收稿日期：2015-09-11，改回日期：2015-11-03

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604040

第一作者：碩士研究生(謝宏副教授為通訊作者，E-mail：syxiehong@163.com)。