李晗雪，楊　凱，付小娟，趙　欽

重慶醫(yī)科大學(xué)　附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

LI Han-xue，YANG Kai，F(xiàn)U Xiao-juan，ZHAO Qin

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·論著·

生物鐘基因Per1對人口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和調(diào)控機(jī)制

李晗雪，楊凱，付小娟，趙欽

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

摘要：目的探討生物鐘基因Per1對人口腔鱗癌細(xì)胞SCC15增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制。方法采用RNA干擾技術(shù)沉默SCC15細(xì)胞內(nèi)Per1基因，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測沉默后細(xì)胞的增殖和凋亡水平，Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Ki- 67、鼠雙微基因2(MDM2)、c-Myc、p53、Bax、Bcl- 2、金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果沉默SCC15癌細(xì)胞內(nèi)Per1基因后促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，抑制了細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力 (P均<0.05)。Per1基因的低表達(dá)顯著提高了Ki- 67、MDM2、Bcl- 2、MMP2 和MMP9 mRNA的表達(dá)(P均<0.05)，降低了c-Myc、p53和Bax mRNA的表達(dá)(P均<0.05)，而VEGF mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論生物鐘基因Perl能調(diào)控下游重要的腫瘤相關(guān)基因Ki- 67、MDM2、c-Myc、p53、Bax、Bcl- 2、MMP2和MMP9，其表達(dá)變化影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，對Per1深入研究有可能進(jìn)一步明確癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為癌癥的治療提供新的有效分子靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：生物鐘基因；Per1；口腔；癌；鱗狀細(xì)胞

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：155-163

研究表明哺乳動物體內(nèi)的許多生命活動，如激素分泌、細(xì)胞代謝活動等，均表現(xiàn)出近似24 h的周期波動，稱為晝夜節(jié)律[1- 3]。晝夜節(jié)律的產(chǎn)生是由細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因呈晝夜節(jié)律性表達(dá)所導(dǎo)致[1- 4]。生物鐘基因存在于體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)[4- 6]。光線是影響晝夜節(jié)律的因素之一，但在無光線的黑暗環(huán)境下，機(jī)體的生命活動仍表現(xiàn)為近似24 h的周期波動，因此，晝夜節(jié)律是生命活動固有的內(nèi)在基本特征[2，5，7]。目前人們已發(fā)現(xiàn)14個(gè)生物鐘基因：周期蛋白(period，Per)1、Per2、Per3、隱花色素(cryptochrome，Cry)l、Cry2、晝夜節(jié)律運(yùn)動輸出周期故障、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1、永恒蛋白、酪氨酸激酶ε、神經(jīng)元PAS域蛋白2、核受體、軟骨細(xì)胞差異表達(dá)基因(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene，Dec)1、Dec2、視黃酸受體相關(guān)的孤兒受體[2- 3，7- 9]。生物鐘基因具有3個(gè)重要功能：第一，生物鐘基因通過周期性表達(dá)產(chǎn)生的晝夜節(jié)律使復(fù)雜的生命活動相互協(xié)調(diào)有序；第二，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化，生物鐘基因可通過重置作用適應(yīng)環(huán)境的變化[2，4- 5]；第三，哺乳類動物基因組中有2%～10%的基因受到生物鐘基因的調(diào)控，這些基因被稱為鐘控基因[10- 12]，生物鐘基因可通過對下游鐘控基因的調(diào)控影響細(xì)胞的生命活動。Per1是重要的生物鐘基因，它具有維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定和控制節(jié)律周期的作用[4，13]。近年研究表明，Per1的異常表達(dá)不僅與哺乳動物的晝夜節(jié)律改變有關(guān)，而且與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6- 8，13- 16]，晝夜節(jié)律與細(xì)胞周期具有密切聯(lián)系，Per1異常表達(dá)導(dǎo)致下游鐘控細(xì)胞周期相關(guān)基因，如細(xì)胞周期蛋白(cyclin) B1、Cyclin D、CyclinE、Wee- 1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 (cyclin-dependent kinase 1，CDK1)和p53的異常表達(dá)，Per1是通過調(diào)控細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)對DNA損傷的修復(fù)能力從而促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[6，17- 18]。但癌癥的發(fā)生是個(gè)十分復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、侵潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管形成等眾多因素[7- 8，16，19- 20]。為進(jìn)一步探討Per1基因與癌癥發(fā)生的關(guān)系，本研究通過RNA干擾技術(shù)對人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞內(nèi)的Per1基因沉默，檢測Per1沉默后對人口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲和腫瘤新生血管形成的影響，并對調(diào)控這些細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)重要基因Ki- 67、鼠雙微基因2(murine double minute 2，MDM2)、c-Myc、P53、Bax、Bcl- 2、金屬蛋白酶(metalloproteinase，MMP)2、MMP9和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)改變情況進(jìn)行檢測，以進(jìn)一步闡明生物鐘基因Per1與癌癥發(fā)生的機(jī)制。

材料和方法

材料總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa，日本)，QIAGEN質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen，德國)，慢病毒干擾表達(dá)質(zhì)粒PLKO.1、scramble質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒混合套裝(Sigma，美國)，Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)。

短發(fā)夾RNA慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定根據(jù)人周期蛋白1的mRNA序列 (GenBank Accession：NM_002616.2)，按照Reynolds A的RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則[21]，針對Per1基因3個(gè)不同靶點(diǎn)的序列(Per1-Ⅰ：CAGCACCACTAAGCGTAAATG；Per1-Ⅱ：CCAGCACC-ACTAAGCGTAAAT；Per1-Ⅲ：CCATGGACATGTCCACCTATA)分別設(shè)計(jì)合成3條Per1干擾序列，即Per1-短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)-Ⅰ，Per1-shRNA-Ⅱ和Per1-shRNA-Ⅲ(表1)。然后用T4 DNA連接酶分別與Age I/EcoR Ⅰ雙酶切的載體PLKO.1連接，構(gòu)建Per1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ慢病毒質(zhì)粒，同時(shí)以不含Per1片段的scramble質(zhì)粒為對照(序列為5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTT AACCTTAGG- 3’)。將以上慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Dpα，然后涂布于含氨基核苷類抗生素的LB固體培養(yǎng)基上抗性培養(yǎng)，將形成的單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)液中恒溫?fù)u菌(37℃，300 r/min)14 h。然后按照Qiagen質(zhì)粒抽提說明書提取質(zhì)粒后進(jìn)行DNA測序，序列測定結(jié)果用軟件Chromas V2.1進(jìn)行分析鑒定。

Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒的包裝分別將Per1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ和scramble質(zhì)粒8 μg與20 μl Lipofectamine 2000混勻，室溫下溫育20 min后轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中(細(xì)胞密度70%～80%)培養(yǎng)48 h(37℃、5%CO2)，用孔徑為0.45 μm的濾過器過濾293T細(xì)胞上清液獲得4組病毒質(zhì)粒液，分裝保存于病毒管中(-80℃)。

Per1-shRNA質(zhì)粒病毒感染SCC15癌細(xì)胞對數(shù)生長期的人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC15細(xì)胞接種于5 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液4 ml，然后各加入1 ml質(zhì)粒病毒液和5 μl聚凝胺，培養(yǎng)24 h后(37℃、5%CO2)更換含2 μg/ml 嘌呤霉素的培養(yǎng)液，每日1次，7 d后獲得Per1穩(wěn)定干擾的SCC15細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為5組。Per1-shRNA-I、Per1-shRNA-Ⅱ和Per1-shRNA-Ⅲ組：即分別轉(zhuǎn)染Per1-shRNA-Ⅰ、Per1-shRNA-Ⅱ和Per1-shRNA-Ⅲ質(zhì)粒病毒的SCC15細(xì)胞；對照組：即轉(zhuǎn)染scramble質(zhì)粒病毒的SCC15細(xì)胞；SCC15細(xì)胞組：即未做任何處理的SCC15細(xì)胞作為空白對照。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各基因mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行，簡述如下：(1)細(xì)胞總RNA的提?。河迷噭┖刑崛〖?xì)胞中的總RNA，用核酸蛋白分析儀測定在波長260 nm及280 nm處的光密度(optical density，OA) 值，計(jì)算RNA濃度和純度。(2)cDNA的合成：用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，首先將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為10 μl，反應(yīng)條件如下：37℃，15 min，85℃ 5 s。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)、合成目的基因Per1、Ki- 67、MDM2、c-Myc、p53、Bax、Bcl- 2、MMP2、MMP9、VEGF和內(nèi)參基因β-actin的引物(表2)。反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μl，濃度均為0.4 μmol/L的上游引物和下游引物各1 μl，DNA 模板2 μl(相當(dāng)于100 ng)，滅菌滅酶蒸餾水8.5 μl。反應(yīng)液總體積為25 μl。反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性1.5 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。60℃延伸時(shí)采集熒光信號，采用2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表 1　Per1-shRNA 3組干擾序列

Per1：周期蛋白1；shRNA：短發(fā)夾RNA

Per1：period 1；shRNA：short hairpin RNA

表 2　各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

MDM2：鼠雙微基因2；MMP：金屬蛋白酶；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

MDM2：murine double minute 2；MMP：metalloproteinase；VEGF：vascular endothelial growth factor

Western blot檢測PER1蛋白的表達(dá)用預(yù)冷的刮刀將各組感染細(xì)胞刮下，放入RIPA 裂解液后于冰上裂解細(xì)胞30 min，轉(zhuǎn)子半徑8.65 cm的離心機(jī)上離心(4℃ 12 000 r/min)15 min，取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行 6%SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗為兔抗人Per1多克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶3 000)，4℃搖床過夜，用PBS清洗3次，加入二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。洗膜3遍后，ECL發(fā)光液均勻滴加在硝酸纖維素膜上，于化學(xué)發(fā)光儀曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照并測量條帶灰度值，計(jì)算PER1和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖與凋亡指數(shù)對數(shù)生長期Per1-shRNA-I、對照-shRNA和SCC15 3組細(xì)胞分別用0.25%胰酶消化后吹打制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)子半徑14 cm的離心機(jī)上離心(1 000 r/min，4℃) 5 min后去上清液，用PBS液洗滌2次，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml備用。細(xì)胞增殖檢測：分別取1 ml各組細(xì)胞懸液，然后加入-20℃、濃度為70%的乙醇0.5 ml固定，4℃冰箱過夜后在轉(zhuǎn)子半徑14 cm的離心機(jī)上離心(1 000 r/min，4℃) 5 min，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2遍，加入碘化丙啶染液1 ml，4℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖指數(shù)，細(xì)胞增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。分別取1 ml各組細(xì)胞懸液加入200 μl AnnexinV-FITC染色液于室溫下避光放置15 min，再加碘化丙啶染料1 ml混勻5 min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/所測細(xì)胞總數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力取對數(shù)生長期Per1-shRNA-I、對照-shRNA和SCC15 3組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，轉(zhuǎn)子半徑14 cm的離心機(jī)上離心(1 000 r/min)5 min后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)。Transwell小室被孔徑為8 μm的聚碳酸多孔濾膜分為上、下兩室，在Transwell小室的上室中加入100 μl的細(xì)胞懸液，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基800 μl，培養(yǎng)(37℃、5%CO2)24 h后取出小室，室溫下用甲醇固定細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽擦去聚碳酸多孔濾膜上室面上未遷移的細(xì)胞，然后用200 倍光鏡觀察聚碳酸多孔濾膜的下室面，隨機(jī)選擇10個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)，即為穿過微孔膜的遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力與前面細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)基本相同，其差異在于Transwell小室的上室和下室間的聚碳酸多孔濾膜表面鋪以基質(zhì)膠液60 μl，其余步驟和方法相同。

結(jié)果

Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果Per1-sh-RNA-Ⅰ～Ⅲ慢病毒質(zhì)粒DNA測序結(jié)果分別與Per1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ正義單鏈序列完全一致(圖1)，證實(shí)3條針對Per1基因的慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

SCC15細(xì)胞感染shRNA質(zhì)粒病毒后Per1 mRNA和蛋白的表達(dá)SCC15細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒病毒前后細(xì)胞形態(tài)有所改變(圖2)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒病毒后SCC15細(xì)胞形態(tài)均變得不規(guī)則，并出現(xiàn)大核、多核細(xì)胞。Per1-shRNA-Ⅰ組細(xì)胞中Per1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著低于SCC15和對照-shRNA組(P均<0.01)(圖3)。證明Per1-shRNA-Ⅰ組的Per1沉默效果最好，用于后面實(shí)驗(yàn)。

SCC15細(xì)胞增殖和凋亡流式細(xì)胞儀分析顯示：Per1-shRNA-I組細(xì)胞的增殖指數(shù)為(48.58±0.59)%，顯著高于對照-shRNA組(43.50±1.32)%和SCC15 組(41.78±0.85)% (P均<0.05)。Per1-shRNA-I組細(xì)胞的凋亡指數(shù)為(16.91±1.78)%，顯著低于對照-shRNA組(20.14±2.00)%和SCC15組(22.13±3.17)% (P均<0.05)。而SCC15與對照-shRNA組細(xì)胞的增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

SCC15細(xì)胞的遷移和侵襲能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Per1-shRNA-I、對照-shRNA和SCC15組細(xì)胞穿過微孔膜的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(113±12)、(31±9)和(32±8)個(gè)，穿過基質(zhì)膠膜的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(52±6)、(23±6)和(21±6)個(gè)(圖5)。Per1-shRNA-I組細(xì)胞穿過微孔膜和基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)顯著高于對照-shRNA和SCC15組 (P均<0.05)，而對照-shRNA和SCC15組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A.Per1-shRNA-Ⅰ組；B.Per1-shRNA-Ⅱ組；C.Per1-shRNA-Ⅲ組

A.Per1-shRNA-Ⅰ group；B.Per1-shRNA-Ⅱ group；C.Per1-shRNA-Ⅲ group

圖 1Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒DNA測序結(jié)果

Fig 1DNA sequencing results of lentivirus Per1-shRNA plasmids

A.SCC15細(xì)胞；B.對照組中SCC15細(xì)胞；C.轉(zhuǎn)染Per1-shRNA-Ⅰ質(zhì)粒病毒的SCC15細(xì)胞；D.轉(zhuǎn)染Per1-shRNA-Ⅱ質(zhì)粒病毒的SCC15細(xì)胞；E.轉(zhuǎn)染Per1-shRNA-Ⅲ質(zhì)粒病毒的SCC15細(xì)胞

A.SCC15 cells；B.SCC15 cells in control-shRNA group；C.SCC15 cells transfected with lentivirus Per1-shRNA-Ⅰ plasmid；D.SCC15 cells transfected with lentivirus Per1-shRNA-Ⅱ plasmid；E.SCC15 cells transfected with lentivirus Per1-shRNA-Ⅲ plasmid

圖 2SCC15細(xì)胞轉(zhuǎn)染Per1-shRNA慢病毒質(zhì)粒前后的光學(xué)顯微鏡下圖片(×200)

Fig 2SCC15 cells transfected and untransfected with lentivirus Per1-shRNA plasmids under microscope (×200)

Mr：相對分子質(zhì)量；與SCC15組和對照-shRNA組比較，aP<0.05，bP<0.01

Mr：relative molecular mass；aP<0.05，bP<0.01 compared with SCC15 and control-shRNA groups

A.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在mRNA水平上檢測Per1基因的沉默效果；B. Western blot檢測Per1基因沉默后PER1蛋白表達(dá)的凝膠成像圖；C. Western blot在蛋白水平上檢測Per1基因的沉默效果

A. effect of Per1 knockdown at mRNA level was detected by real-time polymerase chain reaction；B. gel images of PER1 protein level analyzed by Western blot after Per1 knockdown；C. effect of Per1 knockdown at protein level was detected by Western blot

圖 3SCC15細(xì)胞轉(zhuǎn)染Per1-shRNA質(zhì)粒病毒后Per1 mRNA和蛋白的表達(dá)

Fig 3Expressions of Per1 at mRNA and protein levels in SCC15 cells transfected with lentivirus Per1-shRNA plasmids

PI：碘化丙啶

PI：propidium iodide

A.流式細(xì)胞檢測Per1基因沉默對細(xì)胞增殖的影響；B.流式細(xì)胞檢測Per1基因沉默對細(xì)胞凋亡的影響

A.effect of Per1 knockdown on cell proliferation；B. effect of Per1 knockdown on cell apoptosis

圖 43組細(xì)胞的增殖和凋亡流式細(xì)胞儀分析圖

Fig 4Flow cytometry profiles of proliferation and apoptosis in three groups

沉默Per1后SCC15細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)Per1-shRNA-I組細(xì)胞中Ki-67、MDM2、Bcl-2、MMP2和MMP9 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照-shRNA和SCC15組(P均<0.05)，而c-Myc、p53和Bax mRNA的表達(dá)水平顯著低于對照-shRNA和SCC15組(P均<0.05)；對照-shRNA和SCC15組細(xì)胞中各基因mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；VEGF mRNA的表達(dá)水平在3組中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表3)。

討論

生物鐘基因Per1的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6，8，14- 15，18]。目前研究表明，下調(diào)Per1表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長[6]，過表達(dá)Per1能抑制結(jié)腸癌、前列腺癌和人肺癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7，15，17]。另有研究表明，Per1在口腔鱗癌中低表達(dá)，而且與口腔鱗癌患者的臨床分期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān)[8，16]，提示Per1可能是重要的抑癌基因。

圖 5光學(xué)顯微鏡下3組細(xì)胞的遷移和侵襲圖 (結(jié)晶紫染色，×200)

Fig 5Representative migration and invasion images in three groups under a microscope (crystal violet staining，×200)

表 3　腫瘤相關(guān)基因在Per1-shRNA-I、對照-shRNA和SCC15組中mRNA的表達(dá)水平(x-±s)

P代表單因素方差分析結(jié)果；P1、P2和P3分別代表Per1-shRNA-I組與對照-shRNA組、對照-shRNA組與SCC15組、Per1-shRNA-I組與SCC15組組內(nèi)應(yīng)用LSD法兩兩比較結(jié)果

Pvalue represents the results of differences of each gene expression in three groups analyzed by one-way ANOVA；P1，P2，andP3represent the results of the inter group differences between Per1-shRNA-I and control-shRNA groups，control-shRNA and SCC15 groups，Per1-shRNA-I and SCC15 groups respectively，using LSD test after one-way ANOVA

本研究下調(diào)Per1后不僅能增強(qiáng)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖并降低凋亡，同時(shí)還增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，表明Per1為重要的抑癌基因。

生物鐘基因是通過維持機(jī)體正常晝夜節(jié)律和調(diào)控下游鐘控基因兩方面影響細(xì)胞的生命活動[2，5，10- 13，17- 18]。目前對生物鐘基因Per1是如何維持和控制晝夜節(jié)律產(chǎn)生的機(jī)制方面研究較多，對晝夜節(jié)律產(chǎn)生的機(jī)制已初步清楚，即Per1和其他生物鐘基因相互作用所形成的兩個(gè)正負(fù)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋調(diào)節(jié)環(huán)路而導(dǎo)致晝夜節(jié)律的產(chǎn)生[2，7，14]。但Per1表達(dá)改變導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究較少。由于晝夜節(jié)律和細(xì)胞周期是人體內(nèi)重要的兩大周期活動，因而目前人們的研究主要集中在探討晝夜節(jié)律與細(xì)胞周期兩大周期活動之間的相互作用以及與癌變發(fā)生關(guān)系。目前研究表明晝夜節(jié)律和細(xì)胞周期具有密切聯(lián)系，Per1基因表達(dá)改變會導(dǎo)致下游細(xì)胞周期基因Cyclin B1、Cyclin D、CyclinE、Wee- 1、CDK1、c-Myc和p53表達(dá)改變，Per1表達(dá)改變導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的機(jī)制是通過改變細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)DNA損傷修復(fù)能力[6，17，19]。但癌癥的發(fā)生是個(gè)復(fù)雜的過程，除了細(xì)胞周期異常改變外，還需要腫瘤新生血管形成供給腫瘤生長必需的營養(yǎng)，并需要具有遷移和侵襲的能力等[16，19- 20]。目前研究顯示，除細(xì)胞周期基因外，許多與腫瘤增殖、侵潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管生成的重要基因的表達(dá)也具有以24 h周期波動的晝夜節(jié)律特征，這些基因有細(xì)胞增殖基因Ki- 67[9，22]、原癌基因MDM2[23]、抗凋亡基因Bcl- 2[19]、促凋亡基因Bax[19]、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移基因MMP9[3]以及腫瘤新生血管生成基因VEGF[9，20]等，表明這些基因也是被生物鐘基因調(diào)控的鐘控基因，但目前不知道這些基因是否被Per1所調(diào)控。本研究顯示在口腔鱗癌細(xì)胞中，沉默Per1基因后導(dǎo)致下游Ki- 67、MDM2、Bcl- 2、MMP2和MMP9的表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低，從而增強(qiáng)了癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)降低癌細(xì)胞凋亡水平。本研究結(jié)果也表明，沉默Per1基因后，細(xì)胞周期基因c-Myc和p53的表達(dá)降低，這與Gery等[17]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)沉默Per1后VEGF mRNA的表達(dá)水平無改變。其原因可能是本研究細(xì)胞的培養(yǎng)條件未能達(dá)到VEGF高表達(dá)所需的缺氧狀態(tài)[20，24]，也可能是VEGF不受Per1基因的調(diào)控，而是被其他生物鐘基因所調(diào)控。

Per1作為重要的生物鐘基因，其表達(dá)變化可導(dǎo)致晝夜節(jié)律和細(xì)胞周期的改變，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6，20，23]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了Per1基因同時(shí)還調(diào)控下游許多重要的腫瘤相關(guān)基因Ki- 67、MDM2、Bax、Bcl- 2、MMP2和MMP9。因此，對Per1深入研究有可能進(jìn)一步明確癌癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為癌癥的治療提供新的有效分子靶點(diǎn)。

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Effect and Regulatory Mechanism of Clock Gene Per1 on Biological Behaviors of Human Oral Squamous Carcinoma Cell

LI Han-xue，YANG Kai，F(xiàn)U Xiao-juan，ZHAO Qin

Department of Oral and Maxillofacial Surgery，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect and regulatory mechanism of clock gene Per1 on the proliferation，apoptosis，migration，and invasion of human oral squamous carcinoma SCC15 cells. MethodsRNA interference was used to knock down Per1 gene in human oral squamous cell carcinoma SCC15 cell line. Changes of cell proliferation and apoptosis were analyzed by flow cytometry. Transwell assay was carried out to assess cell migration and invasion. Real-time polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expressions of Ki- 67，murine double minute 2(MDM2)，c-Myc，p53，Bax，Bcl- 2，metalloproteinase (MMP)2，MMP9，and vascular endothelial growth factor (VEGF). ResultsshRNA-mediated knockdown of Per1 promoted the proliferation，migration and invasion capacity，and inhibited cell apoptosis capacity of SCC15 cells (all P<0.05). Additionally，Per1 knockdown also increased the mRNA expressions of Ki-67，MDM2，Bcl-2，MMP2，and MMP9 and decreased the mRNA expressions of c-Myc，p53，and Bax (all P<0.05)；however，the VEGF mRNA expression did not differ significantly after Per1 knockdown (P>0.05). ConclusionsClock gene Perl can regulate important tumor-related genes downstream such as Ki- 67，MDM2，c-Myc，p53，Bax，Bcl- 2，MMP2，and MMP9，and the aberrant expression of Per1 can affect tumor cell proliferation，apoptosis，migration and invasion. An in-depth study of Per1 may further clarify the mechanism of tumorigenesis and tumor development and thus provides new effective molecular targets for cancer treatment.

Key words：clock gene；Per1；oral cavity；carcinoma；squamous cell

(收稿日期：2015- 11- 02)

Corresponding author：YANG KaiTel：023- 89012907，E-mail：cqfyyk@aliyun.com

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.006

中圖分類號:R739.8；R852.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)02- 0155- 09

通信作者：楊凱電話：023- 89012907，電子郵件：cqfyyk@aliyun.com