廖 麗，王曉麗，劉建秀，劉 洋，白昌軍，徐毓皎，張欣怡，王志勇

(1.熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

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地毯草種質(zhì)資源ISSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

廖 麗1，王曉麗1，劉建秀2，劉 洋1，白昌軍3，徐毓皎1，張欣怡1，王志勇1

(1.熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 海口 570228；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014； 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

摘要：地毯草(Axonopus compressus)是華南地區(qū)使用的多年生草本植物，本研究通過ISSR標(biāo)記對華南地區(qū)64份地毯草種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，25對ISSR引物共擴(kuò)增出208條清晰譜帶，大小在300～1 500 bp，其中多態(tài)性條帶有196條，多態(tài)性比率為94.23%，25對引物擴(kuò)增條帶數(shù)在4～15條，平均每對引物8.32條，遺傳相似系數(shù)是0.46～0.99。通過UPGMA方法對64份地毯草材料進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，來自相同采集地區(qū)的材料并沒有完全聚在一類，供試材料間出現(xiàn)較大的遺傳差異。本研究結(jié)果可為今后開展地毯草種質(zhì)資源遺傳保護(hù)、品種鑒定、新品種選育提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：地毯草；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

地毯草(Axonopuscompressus)，別名大葉油草，屬禾本科地毯草屬多年生草本植物，暖季型草坪草。其中地毯草屬約有40個(gè)種，在我國主要分布在熱帶和亞熱帶等氣候溫暖濕潤地區(qū)，但是地毯草不耐寒，氣溫變低時(shí)葉色就會(huì)呈現(xiàn)紫紅色，植株枯黃，影響觀賞價(jià)值和使用價(jià)值[1]。目前世界各國對地毯草種質(zhì)資源的研究還只停留在一些簡單的調(diào)查上, 還沒有把性狀的鑒定與控制性狀的基因以及基因的傳遞和變異規(guī)律的研究結(jié)合起來，但在地毯草屬的形態(tài)多樣性[2-4]、抗逆性[5-9]、分子標(biāo)記[10-11]等方面的研究較多。

目前，ISSR標(biāo)記技術(shù)[12]具有操作簡單、成本低、快速靈敏、多態(tài)性高、所需DNA 量少以及無需預(yù)知研究對象的基因組序列等優(yōu)點(diǎn), 同時(shí)也具有SSR 的穩(wěn)定性。且ISSR標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于品種鑒定[13]、遺傳多樣性分析[14-17]等研究，然而，地毯草種質(zhì)資源分子標(biāo)記研究甚少[10-11,18]。席嘉賓等[19]利用15個(gè)野生地毯草品系建立了ISSR的反應(yīng)體系并進(jìn)行了遺傳多樣分析。本研究在此基礎(chǔ)上，利用ISSR標(biāo)記對國內(nèi)外63份野生地毯草種質(zhì)和1份育成品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，為今后地毯草種質(zhì)開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

64份材料分別來源于中國的海南、廣州、廣西、云南、福建和貴州以及澳大利亞(表1)，種植在海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)學(xué)院基地并統(tǒng)一管理。

1.2基因組DNA的提取和檢測

地毯草基因組DNA的提取參照改良的CTAB法[20]，并做了適當(dāng)?shù)男薷?。取DNA原液5 μL，加入1 μL的上樣緩沖液，混勻，然后用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(其中電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓3～4 V·cm-1電泳30 min), 最后稀釋成50 ng·μL-1備用。

1.3ISSR-PCR擴(kuò)增體系

ISSR反應(yīng)體系(20 μL)和擴(kuò)增程序?yàn)閇16,19]：2 μL 10 × buffer (100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3,500 mmol·L-1KCl,15 mmol·L-1MgCl2)；1.8 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，1 μL 50 ng模板 DNA;1 μL 10 μmol·mL-1ISSR引物(表2);1 μL 5 U·μL-1Taq DNA聚合酶;無菌去離子水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，45～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共45 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.4ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測

擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物8.5 μL與2 μL 6×Loading Buffer(TaKaRa)混勻，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，電壓4 V·cm-1,時(shí)間1.5～2 h，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳結(jié)束后取出凝膠，在凝膠成像儀上檢測照相，進(jìn)行分析。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增出來的電泳圖譜進(jìn)行人工讀帶，對電泳圖譜上清晰可辨且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”，無則記為“0”，從而生成原始數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Means Cluster Analysis)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳相似性聚類分析。遺傳相似系數(shù)(GS)=2Nij/(Ni+Nj)，式中，Nj為第j個(gè)品種的擴(kuò)增條帶數(shù)目，Ni為第i個(gè)品種的擴(kuò)增條帶數(shù),Nij代表第i、j個(gè)品種間共有的擴(kuò)增條帶數(shù)[21]。

2結(jié)果與分析

2.1ISSR標(biāo)記對地毯草種質(zhì)擴(kuò)增的多態(tài)性分析

本研究按最佳反應(yīng)程序及體系最終從ISSR 801到ISSR 900共100對引物中篩選出25對穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、條帶清晰且重復(fù)性好的引物，用于64份地毯草種質(zhì)的擴(kuò)增。25對引物共擴(kuò)增出208條條帶清晰譜帶，大小在300～1 500 bp，其中多態(tài)性條帶有196條，單對引物擴(kuò)增條帶數(shù)在4～15條，平均每對引物8.32條，多態(tài)性比率為94.23%(表2)。引物ISSR 811擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性條帶數(shù)為15條，其多態(tài)性最豐富，但是ISSR 856的擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜最清晰(圖1)。

2.2遺傳相似性分析

相似系數(shù)是用來比較群體或個(gè)體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度,相似系數(shù)越高,則說明材料間親緣關(guān)系越近,遺傳背景一致性越強(qiáng)。64份地毯草種質(zhì)遺傳相似系數(shù)范圍為0.46～0.99。遺傳相似系數(shù)最高的是來自廣西合浦的A107和A108品系，相似系數(shù)為0.99，表示親緣關(guān)系最近；親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是來自廣東惠州的A54品系和廣東遂溪的A126品系，其遺傳相似系數(shù)為0.46，表明這些種質(zhì)具有比較高的遺傳多樣性。

表1　供試材料

2.3ISSR標(biāo)記的聚類分析

用UPGMA法對64份地毯草材料進(jìn)行聚類分析(圖2)，從繪出的樹狀聚類圖可以看出，在遺傳相似系數(shù)0.74處，將64份地毯草種質(zhì)材料分為3類：第Ⅰ類由25個(gè)材料組成，分別來自海南(A2、A3、A4、A5、A7、A15、A16、A37、A30、A38、A102、A141)、福建(A57、A59、A81、A83、A84)、廣東(A45、A58、A99)、廣西(A82)、云南(A47、A63)、貴州(A49)和澳大利亞(A46)；第Ⅱ類也包括25個(gè)材料，分別來自海南(A19、A114、A139、A105)、福建(A51)、廣東(A98、A113、A118、A116、A121、A123、A122、A126、A100)、廣西(A94、A101、A106、A107、A108、A111、A120、A140)和云南(A72、A97、A95)；第Ⅲ類包括14份種質(zhì)，分別來自海南(A23、A28、A34、A42、A103)、廣東(A54)、廣西(A52、A87、A88、A25)、云南(A41、A63、A67、A70)和福建(A86)，從聚類結(jié)果來看，來自相同采集地區(qū)的材料并沒有完全聚在一類，供試材料間出現(xiàn)較大的遺傳差異。

表2　ISSR分析所用的引物序列和擴(kuò)增結(jié)果

3討論與結(jié)論

由于ISSR標(biāo)記具有較好的穩(wěn)定性和多態(tài)性[13]。ISSR標(biāo)記在研究植物遺傳多樣性方面被認(rèn)為是一種非常有效的方法并具有很大的應(yīng)用潛質(zhì)[12,22-24]。在本研究中，通過ISSR標(biāo)記分析了64份地毯草種質(zhì)，顯示出了豐富的多態(tài)性，這表明ISSR標(biāo)記用于研究地毯草遺傳多樣性的可行性，這與席嘉賓等[19]對野生地毯草的研究結(jié)果一致。

在本研究中，25對ISSR引物共獲得了196條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為94.23%；席嘉賓等[2]用優(yōu)化的ISSR反應(yīng)體系分析中國野生地毯草種質(zhì)，得到的多態(tài)性比率為89.67%；Wang等[16]用ISSR標(biāo)記分析狗牙根的遺傳多樣性，多態(tài)性比率為86.7%，以上結(jié)果都顯示了ISSR標(biāo)記具有豐富的遺傳多樣性。

圖1　64份材料DNA用ISSR 856引物擴(kuò)增圖譜

圖2　64份地毯草種質(zhì)的ISSR聚類分析結(jié)果

從64份地毯草的聚類分析結(jié)果來看，具有相同或相近地理來源的材料被聚在了一類，但也有不同來源的材料被聚在一類。這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在其它種類中[11,16-18,25]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要有以下4個(gè)方面：1)有相同地理來源的材料雖然來自相同的環(huán)境，但由于育種材料和選擇方向的復(fù)雜性，可能會(huì)出現(xiàn)遺傳差異比較大的類型，因此，相同地理來源的材料被歸入不同的類群；2)受環(huán)境的影響，在長期適應(yīng)環(huán)境的過程中物種也會(huì)出現(xiàn)性狀趨同的現(xiàn)象，造成不同性狀間的交叉；3)地毯草屬于多倍體[20]，在決定遺傳分化中起了重要作用[18]，因此，為了進(jìn)一步了解不同地毯草種質(zhì)間的關(guān)系，在本研究的基礎(chǔ)上，還需進(jìn)一步分析地毯草的倍性，因?yàn)楸缎苑植伎赡苋Q于環(huán)境的影響，或者基因型的進(jìn)化和歷史發(fā)展[26-28]。對狗牙根(Cynodondactylon)[29]和類地毯草(A.affinis)[18]遺傳多樣性和倍性的研究也得到了類似結(jié)果。4)地毯草是多年生禾本科草和異型雜交繁育體系，也可導(dǎo)致豐富的遺傳變異[16,18]，另外，有大的生態(tài)隔離也是必要的，例如：瓊州海峽就可導(dǎo)致海南省和其它省份間種質(zhì)的高變異，這種地理分布可以顯著影響一個(gè)物種的遺傳多樣性。

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Corresponding:Wang Zhi-yongE-mail:wangzhiyong@hainu.edu.cn

Analysis of genetic diversity ofAxonopuscompressususing ISSR markers

Liao Li1, Wang Xiao-li1, Liu Jian-xiu2, Liu Yang1, Bai Chang-Jun3,Xu Yu-jiao1, Zhang Xin-yi1,Wang Zhi-yong1

(1.Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources,Ministry of Education, College of Agronomy Hainan University, Haikou 570228, China;2.Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China;3.Tropical Pasture Research Center,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China)

Abstract:Axonopus compressus is perennial herbaceous plants and used in south China. Genetic diversity of 64 carpetgrass accessions (cultivar) was analyzed using the ISSR markers. The results showed that 25 ISSR primers generated 208 distinct bands (300～1 500 bp), 196 (94.23%) of which were polymorphic bands. The number of observed bands ranged from 4 to 15, with average of 8.3. The genetic similarity coefficient is between 0.46～0.99. Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) clustered 64 accessions (cultivar) into three groups, and not all samples from the same region belonged to the same group. ISSR markers has potential in marker-assisted breeding and the assessment of genetic diversity in wild germplasm resources of carpetgrass.

Key words:Axonopus compressus; germplasm; ISSR; genetic diversity

中圖分類號：S540.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-0629(2016)4-0608-07*

通信作者：王志勇(1979-)，男，江西樂平人，副教授，博士，研究方向?yàn)闊釒Р萜翰莘N質(zhì)資源遺傳多樣性與遺傳育種。E-mail:wangzhiyong@hainu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060266)；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(310031)

收稿日期：2015-08-24接受日期：2015-12-08

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0472

廖麗,王曉麗,劉建秀,劉洋,白昌軍,徐毓皎,張欣怡,王志勇.地毯草種質(zhì)資源ISSR標(biāo)記遺傳多樣性分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(4)：608-614.

Liao L,Wang X L,Liu J X,Liu Y,Bai C J,Xu Y J,Zhang X Y,Wang Z Y.Analysis of genetic diversity ofAxonopuscompressususing ISSR markers.Pratacultural Science，2016,33(4)：608-614.

第一作者：廖麗(1981-)，女，江西樂安人，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锓N質(zhì)資源遺傳多樣性與質(zhì)量評價(jià)。E-mail:liaoli@hainu.edu.cn