陳朝紅 綜述 劉志紅 審校

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

模式動(dòng)物斑馬魚在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

陳朝紅 綜述 劉志紅 審校

斑馬魚的腎單位結(jié)構(gòu)、功能和分子組成與高等哺乳動(dòng)物后腎高度保守，已廣泛應(yīng)用于腎臟領(lǐng)域的研究。本文將介紹斑馬魚腎臟的基本生物學(xué)特征，闡述斑馬魚在腎臟發(fā)育及多種腎臟疾病中的應(yīng)用。斑馬魚模型適合于多重基因編輯及高通量基因功能篩查，在功能基因組學(xué)研究中極具前景。

斑馬魚 腎臟發(fā)育 腎臟疾病 足細(xì)胞 急性腎損傷

斑馬魚是近年發(fā)展的脊椎動(dòng)物模式生物,兼具“ 大 ” (小鼠 )和“ 小 ”(酵母、 線蟲和果蠅 )模式生物的綜合優(yōu)勢(shì)，被視為連接非脊椎動(dòng)物 (小模式生物體 )和哺乳動(dòng)物(大模式生物 )的“橋梁”。斑馬魚體型小，易于飼養(yǎng)維護(hù)；產(chǎn)卵量大,生長(zhǎng)快,適合于高通量基因功能篩查，是功能基因組學(xué)研究的重要工具。斑馬魚腎臟在結(jié)構(gòu)、功能和分子組成上均與人類腎臟相似，且斑馬魚具有獨(dú)特的生理特征,如體外受精和體外發(fā)育,胚胎透明等,為人類腎臟發(fā)育和腎臟疾病的研究提供可視化窗口[1]。

本文就近年來斑馬魚在腎臟領(lǐng)域研究中的應(yīng)用作一綜述，重點(diǎn)闡釋斑馬魚在腎臟發(fā)育、腎小球疾病、急性腎損傷(AKI)和腎臟再生、多囊性腎病等領(lǐng)域中的應(yīng)用及進(jìn)展。

斑馬魚在腎臟發(fā)育研究中的應(yīng)用

從魚類到哺乳動(dòng)物，腎臟發(fā)育均起源于中胚層。哺乳動(dòng)物的腎臟發(fā)育經(jīng)歷前腎、中腎和后腎三個(gè)階段，前腎和中腎是哺乳動(dòng)物胚胎時(shí)期的暫時(shí)器官，作為后腎分化的前驅(qū)階段，它們出現(xiàn)不久即逐漸退化，只有后腎繼續(xù)發(fā)育成體內(nèi)永久性的泌尿器官。斑馬魚的腎臟發(fā)育經(jīng)歷前腎和中腎兩個(gè)階段，其腎單位與哺乳動(dòng)物/人類的后腎在結(jié)構(gòu)和功能上非常相似。前腎是斑馬魚胚胎和幼魚階段的功能性泌尿器官，受精后80h(80hpf)發(fā)育成熟，由起源于魚體兩側(cè)條狀胚層的腎祖細(xì)胞分化形成兩個(gè)腎單位，兩個(gè)腎單位前端的腎小球在第3體節(jié)處背主動(dòng)脈腹側(cè)融合，余下的中胚層細(xì)胞經(jīng)歷間充質(zhì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(MET)，向后形成腎小管和導(dǎo)管，共同開口于泄殖腔(圖1)。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，斑馬魚前腎腎單位有8個(gè)功能區(qū)，與哺乳動(dòng)物后腎相似，從頭部向尾部，依次為腎小球、頸部(球管連接部)、近曲小管、近直小管、遠(yuǎn)端小管前段、斯坦尼氏小體(CS)、遠(yuǎn)端小管后段和前腎導(dǎo)管[2]。中腎腎單位在受精后12～14dpf開始形成,前腎隨之在30～60dpf退化。中腎發(fā)育成熟后，后續(xù)生命過程中還會(huì)不斷有新的腎單位產(chǎn)生，以適應(yīng)體重增加和損傷后修復(fù)的需要[3]。

圖1 斑馬魚前腎發(fā)育過程紅色代表間介中胚層,藍(lán)色代表前腎上皮結(jié)構(gòu)；12 hpf：受精后12h

由于哺乳動(dòng)物胚胎于體內(nèi)發(fā)育，腎臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以研究，人們對(duì)于腎臟發(fā)生和腎單位結(jié)構(gòu)分段的過程和機(jī)制了解較少。斑馬魚腎臟結(jié)構(gòu)和功能與人腎臟高度保守，近年來通過對(duì)斑馬魚腎臟發(fā)育的研究，發(fā)現(xiàn)pax2a、pax8，wt1a/b、irx3b等轉(zhuǎn)錄因子和視黃酸信號(hào)通路在腎臟發(fā)育和腎單位節(jié)段化形成過程中具有重要作用[4]。

pax (paired box)是一類控制器官發(fā)育的基因家族，其中pax2a與腎臟發(fā)育關(guān)系密切。斑馬魚5～15體節(jié)期的前腎祖細(xì)胞區(qū)表達(dá)pax2a和pax8。研究顯示pax2a在斑馬魚腎臟球管連接部，即頸部發(fā)育形成中發(fā)揮了重要作用，誘導(dǎo)間質(zhì)向成熟上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在pax2a基因突變的斑馬魚模型中，pax2a的功能缺失導(dǎo)致胚胎異位表達(dá)WT1于原頸部區(qū)域的小管細(xì)胞，導(dǎo)致這些細(xì)胞不表達(dá)小管上皮細(xì)胞的標(biāo)志物Na+/K+ATP酶蛋白，而是表達(dá)足細(xì)胞分化標(biāo)志物——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α(VEGF-α)，顯示足細(xì)胞和頸部小管細(xì)胞定向發(fā)育異常。這一發(fā)現(xiàn)提示pax2a與WT1相互制衡，分別誘導(dǎo)腎祖細(xì)胞特異性向腎小管細(xì)胞和足細(xì)胞定位及分化[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，ponzr1(plac8 onzin related protein 1)是重要的pax2a調(diào)節(jié)子之一。ponzr1是正向遺傳技術(shù)篩選出的與斑馬魚器官發(fā)生密切相關(guān)基因。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，ponzr1表達(dá)于前腎和咽弓。嗎啉基(Morpholino)特異性抑制ponzr1后，24hpf斑馬魚在魚體中線區(qū)域異位表達(dá)pax2a，中線區(qū)域細(xì)胞同時(shí)表達(dá)WT1a和nphs2，導(dǎo)致足細(xì)胞分化異常，斑馬魚不能發(fā)育形成功能性腎小球[6]。上述研究進(jìn)一步顯示了pax2a的表達(dá)和分布對(duì)于足細(xì)胞和頸部細(xì)胞正常發(fā)育的重要作用。

視黃酸在脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和細(xì)胞分化，尤其是胚胎發(fā)育過程中有重要作用，調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生過程中多器官形成。視黃酸的合成與代謝受到酶的調(diào)節(jié)，攝入的維生素A(視黃醇)經(jīng)視黃醇脫氫酶氧化為視黃醛，再經(jīng)視黃醛脫氫酶(aldhs)氧化為視黃酸。Cheng等發(fā)現(xiàn)[7]，視黃酸合成酶aldh2缺失的突變斑馬魚模型或視黃酸合成抑制劑-二乙基氨基苯(DEAB)作用的胚胎，腎小球足細(xì)胞和近端腎小管發(fā)育阻滯，外源性給予視黃酸可逆轉(zhuǎn)損傷，提示視黃酸信號(hào)在誘導(dǎo)足細(xì)胞和近端小管分化中的作用。de Groh等[8]研究發(fā)現(xiàn)，2hpf斑馬魚胚胎經(jīng)組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑PTBA、PBA或TSA作用，可劑量依賴性誘導(dǎo)腎祖細(xì)胞增加，在顯性負(fù)性(dorminant-negative)視黃酸受體突變斑馬魚模型中，視黃酸信號(hào)通路的阻斷可拮抗組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑對(duì)腎祖細(xì)胞的效應(yīng)，提示視黃酸信號(hào)通路介導(dǎo)了組蛋白去乙?；?HDAC)對(duì)腎祖細(xì)胞分化發(fā)育的影響。

斑馬魚模型在腎小球疾病研究中的應(yīng)用

腎臟的發(fā)育和行使功能需要固有細(xì)胞協(xié)調(diào)作用。足細(xì)胞在腎小球毛細(xì)血管袢的形成中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。斑馬魚前腎足細(xì)胞表達(dá)VEGF和血管生成素2，趨化表達(dá)VEGF受體和內(nèi)皮細(xì)胞早期分化標(biāo)志物FIK-1的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腎小球上皮細(xì)胞區(qū)域，形成毛細(xì)血管袢。floating head基因突變的斑馬魚胚胎背主動(dòng)脈缺失，導(dǎo)致從動(dòng)脈分枝的新生腎小球的血管結(jié)構(gòu)缺失，該突變體的足細(xì)胞持續(xù)表達(dá)WT1和VEGF，可趨化鄰近靜脈Flk-1陽性內(nèi)皮細(xì)胞，形成功能性腎小球。血流剪切力、細(xì)胞外基質(zhì)成分異常也在毛細(xì)血管袢形成起關(guān)鍵作用。在心肌細(xì)胞L型鈣通道基因突變體中，斑馬魚心臟功能異常導(dǎo)致血流缺失，腎小球不能形成毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)缺失，或體內(nèi)注射金屬蛋白酶抑制劑同樣導(dǎo)致毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)異常。

蛋白尿和腎病綜合征動(dòng)物模型在腎小球疾病發(fā)病機(jī)制和篩選靶向治療藥物的研究中必不可少。阿霉素和嘌呤霉素腎病小/大鼠模型是經(jīng)典的嚙齒類腎病模型。研究人員試圖用阿霉素和嘌呤霉素作用斑馬魚腎臟，觀察其對(duì)斑馬魚腎臟的影響。由于高劑量阿霉素有心臟毒性，Zennaro等[9]用低濃度阿霉素(10～20 μmol/L)作用9hpf斑馬魚胚胎48h，胚胎出現(xiàn)心包水腫，足細(xì)胞nephrin、WT1的表達(dá)減少，電鏡下足突融合，70 kD葡聚糖排出率增出，顯示腎小球?yàn)V過膜損傷。但上文已提到，前腎在80hpf才發(fā)育成熟，Zennaro等[9]的研究反映了阿霉素對(duì)腎臟發(fā)育的影響，我們的實(shí)驗(yàn)顯示低濃度阿霉素(10～20 μmol/L)對(duì)80hpf的斑馬魚前腎功能沒有影響。

Hentschel等[10]注射250～350 mg/kg氨基核苷嘌呤霉素于80hpf斑馬魚胚胎的心臟靜脈竇，胚胎在注射后18h(18 dpi)即出現(xiàn)心包和眼周水腫，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步加重，伴足突融合。腎小球?qū)晒鈽?biāo)記70 kD 葡聚糖(dextran)排除實(shí)驗(yàn)顯示，嘌呤霉素能夠加速血管內(nèi)70 kD dextran的排除，注射后24h時(shí)，心臟和視網(wǎng)膜血管內(nèi)的熒光信號(hào)較正常對(duì)照顯著減弱，同時(shí)近端腎小管出現(xiàn)熒光信號(hào)的聚集。但嘌呤霉素模型需將1～5 nl藥物注入斑馬魚胚胎心臟，藥物劑量不易控制，對(duì)胚胎損傷性大。

足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)和功能完整的主要細(xì)胞之一，足細(xì)胞損傷與蛋白尿水平和腎小球硬化密切相關(guān)。Zhou等[11]和Huang等[12]構(gòu)建了可誘導(dǎo)性損傷足細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型(pod:NTR-mCherry)，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚足細(xì)胞上高表達(dá)硝基還原酶(pod:NTR-mCherry)，在含有甲硝唑(MTZ)的溶液中時(shí)，硝基還原酶將甲硝唑的硝基還原為具有細(xì)胞毒性的氨基代謝物，特異性誘導(dǎo)表達(dá)硝基還原酶的足細(xì)胞損傷，斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重足突融合，足細(xì)胞凋亡，隨著腎小球?yàn)V過屏障破壞，斑馬魚出現(xiàn)蛋白尿，眼周和心包水腫。這些表型與足細(xì)胞損傷的嚙齒類動(dòng)物模型和人類腎病綜合征患者表型高度一致，進(jìn)一步支持了斑馬魚作為腎病動(dòng)物模型的有效性。斑馬魚循環(huán)中不含白蛋白，Zhou等[11]建立了肝臟特異性表達(dá)維生素D結(jié)合蛋白(VDBP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(l-fabp:VDBP-GFP)模型，使肝細(xì)胞特異性表達(dá)分泌VDBP。VDBP與白蛋白有相同的肝臟合成模式，分子量和電荷與白蛋白也相似，該轉(zhuǎn)基因模型可用于腎小球屏障功能和蛋白尿測(cè)定與評(píng)估。

應(yīng)用podocin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白/上游激活序列(Gal4/OAS)系統(tǒng)，我們?cè)诎唏R魚足細(xì)胞上特異性高表達(dá)生長(zhǎng)抑制與DNA損傷基因45b(gadd45ba/b)，利用足細(xì)胞可誘導(dǎo)性斑馬魚損傷模型和VDBP轉(zhuǎn)基因斑馬魚，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞上高表達(dá)gadd45b能夠顯著加重MTZ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，gadd45ba/b轉(zhuǎn)基因魚的眼周和心包水腫發(fā)生率、蛋白尿水平均顯著高于野生型斑馬魚,電鏡下足突融合顯著?；钚詂aspase3染色結(jié)果顯示，gadd45b轉(zhuǎn)基因魚發(fā)生凋亡的足細(xì)胞數(shù)顯著高于非轉(zhuǎn)基因魚。Morpholino抑制斑馬魚gadd45ba/b基因表達(dá)，則MTZ誘導(dǎo)的斑馬魚水腫發(fā)生率和蛋白尿水平顯著降低[13]。

Gee等[14]應(yīng)用外顯子測(cè)序和純合子定位技術(shù)(homozygosity mapping and whole-exome sequencing)發(fā)現(xiàn)上皮膜蛋白2突變(EMP2)單基因突變可致腎病綜合征。Wan等[15]應(yīng)用基因組編輯核酸酶TALEN技術(shù)在對(duì)斑馬魚EMP2突變體的研究中，發(fā)現(xiàn)emp2缺失可上調(diào)腎小球內(nèi)窖蛋白1(Caveolin-1)的表達(dá)，并加重MTZ誘導(dǎo)的NTR轉(zhuǎn)基因魚的損傷。在足細(xì)胞上特異性高表達(dá)窖蛋白1，能夠重現(xiàn)emp2斑馬魚突變體的表型，激素類藥物能減少Caveolin-1基因在足細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而改善emp2突變體中足細(xì)胞損傷和蛋白尿。提示Caveolin-1基因可能是一個(gè)新的治療腎病綜合征和足細(xì)胞損傷的藥物靶點(diǎn)。

在組學(xué)時(shí)代，腎小球?yàn)V過屏障功能或蛋白尿發(fā)生相關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)。通過morpholino瞬時(shí)抑制斑馬魚基因表達(dá)，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)核孔蛋白107(Nucleoporin 107 kD，NUP107)[16]，KANK(KN Motif And Ankyrin Repeat Domains)[17],TMEM234(Transmembrane Protein 234)[18]，鼠雙微體2(Murine double minute-2，MDM2)[19]，發(fā)動(dòng)蛋白2 (dynamin2)[20]，Rho-GTPase 結(jié)合蛋白 IQGAP2(IQ Motif Containing GTPase Activating Protein 2)[21]，載脂蛋白L1(APOL1)[22]，ADCK4(AarF Domain Containing Kinase 4)[23]，ARHGDIA[Rho GDP Dissociation Inhibitor (GDI) Alpha][24]，F(xiàn)an1(FANCD2/FANCI-Associated Nuclease 1)等基因缺失可模擬人類腎病表型。Morpholino的結(jié)果還需要在斑馬魚基因突變體中進(jìn)一步驗(yàn)證，Sanger 斑馬魚基因組突變計(jì)劃顯示，只有約20% morpholino表型可在突變體中得到證實(shí)[25]。得益于CRISPR/Cas9等基因組編輯技術(shù)的進(jìn)步，研究人員能夠更加迅速且準(zhǔn)確地編輯基因靶標(biāo)，上述應(yīng)用顯示斑馬魚模型是強(qiáng)大的高通量基因功能篩選評(píng)價(jià)平臺(tái)。

斑馬魚在AKI和腎臟再生研究中的應(yīng)用

AKI是一種常見的臨床綜合征。Hentschel等[26]首次建立了斑馬魚AKI模型，應(yīng)用慶大霉素或順鉑注射50hpf或72hpf的斑馬魚胚胎的心臟靜脈竇，可劑量依賴性誘導(dǎo)斑馬魚模型出現(xiàn)眼周和心包水腫，腎小球和腎小管擴(kuò)張，隨后脫落的上皮細(xì)胞堵塞管腔，造成梗阻；超微結(jié)構(gòu)可觀察到腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體增加，這是氨基糖甙類藥物腎損傷的典型病理特征。在慶大霉素腎損傷斑馬魚血管內(nèi)注入菊粉或10 kD熒光素標(biāo)記葡聚糖，可發(fā)現(xiàn)斑馬魚菊粉清除率和近端腎小管重吸收葡聚糖能力明顯減弱，慶大霉素誘導(dǎo)的上述斑馬魚腎損傷表型與人AKI的臨床表現(xiàn)相似。

Kramer-Zucker等[27]用尖頭鑷物理壓迫斑馬魚泄殖腔，觀察機(jī)械性梗阻對(duì)斑馬魚胚胎腎小管損傷作用，腎小管液流受阻后，30 min內(nèi)腎囊腫形成，囊性擴(kuò)張的腎小管和腎導(dǎo)管恰位于機(jī)械阻塞點(diǎn)前端。進(jìn)一步的工作顯示，這類阻塞性囊腫的形成和纖毛擺動(dòng)率增加與foxj1a基因表達(dá)升高有關(guān)。foxj1a作為FOX家族的成員之一，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子在纖毛生成的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在形成囊腫的局部腎小管上皮細(xì)胞中，可檢測(cè)到foxj1a的表達(dá)上調(diào)。

Johnson等[28]利用激光燒蝕法建立斑馬魚AKI模型。熒光標(biāo)記的低分子葡聚糖注入斑馬魚胚胎后，被近端腎小管上皮細(xì)胞通過內(nèi)吞作用吸收，由于斑馬魚胚胎的光學(xué)透明性，通過熒光顯像，可在顯微鏡下定位近端小管上皮細(xì)胞，通過脈沖式激光系統(tǒng)，針對(duì)性地對(duì)一側(cè)腎單位的上皮細(xì)胞進(jìn)行消融，對(duì)側(cè)完好的腎單位可以作為損傷對(duì)照，同時(shí)也保留了部分腎功能，對(duì)胚胎的損傷小。

目前，人們對(duì)AKI損傷后腎單位再生情況所知甚少。腎損傷分子1(KIM-1)是T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(TIMD4)和甲型肝炎病毒的膜受體，在急性和慢性腎損傷情況下，近曲小管KIM-1表達(dá)上調(diào)。斑馬魚的KIM家族包含KIM-1，KIM-3和KIM-4。Yin等[29]研究顯示，持續(xù)的KIM-1表達(dá)可通過mTOR通路導(dǎo)致斑馬魚慢性腎損害。慶大霉素誘導(dǎo)的斑馬魚腎臟急性損傷中，KIM-1表達(dá)明顯上調(diào)，并且伴斑馬魚的生長(zhǎng)抑制，斑馬魚腎小管組成型或誘導(dǎo)性表達(dá)Kim-1可致小管刷狀緣脫落，GFR降低，心包水腫，魚生長(zhǎng)減緩和死亡率增加。由于KIM-1表達(dá)可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路，研究人員應(yīng)用雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)通路可明顯提高斑馬魚模型的生存率。

視黃酸已應(yīng)用于AKI模型的治療，可減組織損傷和纖維化，但具體機(jī)制不明，Chiba等[30]發(fā)現(xiàn)在小鼠和斑馬魚AKI模型中，視黃酸信號(hào)通路被激活，激活的視黃酸信號(hào)可影響M1和M2型巨噬細(xì)胞平衡。M1型巨噬細(xì)胞參與促炎反應(yīng)，且在宿主防御細(xì)菌和病毒感染中發(fā)揮核心作用。M2巨噬細(xì)胞與抗炎反應(yīng)、組織重構(gòu)、纖維化及腫瘤疾病發(fā)展相關(guān)。AKI后局部視黃酸表達(dá)上調(diào)可抑制M1型促炎巨噬細(xì)胞，減輕AKI后巨噬細(xì)胞依賴的炎性損傷；同時(shí)活化M2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)組織修復(fù)。因?yàn)橐朁S酸信號(hào)在腎臟發(fā)育中起重要作用，而在發(fā)育成熟的腎臟表達(dá)量低，這一發(fā)現(xiàn)提示胚胎發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路參與AKI后的組織修復(fù)。

斑馬魚在囊性腎病發(fā)病機(jī)制及治療中的應(yīng)用

囊性腎病是最普遍的人類遺傳性疾病之一。常染色體顯性多囊腎(ADPKD)的致病基因有多囊蛋白1(PKDl)和多囊蛋白2(PKD2)。常染色體隱性多囊腎(ARPKD)的致病基因?yàn)镻KHDJ。這3種基因編碼的蛋白均位于腎小管上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛內(nèi)，提示纖毛結(jié)構(gòu)、功能異?？赡苁悄夷[形成的共同通路。纖毛是以微管為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的細(xì)胞表面突起。在纖毛的生成階段，軸絲從纖毛的底部向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)，由于纖毛自身沒有合成蛋白的能力，纖毛必須將細(xì)胞漿內(nèi)產(chǎn)生的蛋白從纖毛的底部轉(zhuǎn)運(yùn)到纖毛的頂部，同時(shí)，將細(xì)胞生存內(nèi)環(huán)境的外界信息或者物質(zhì)從纖毛頂部轉(zhuǎn)運(yùn)到纖毛的底部，這就使纖毛擁有正向轉(zhuǎn)運(yùn)和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。纖毛行使雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)就是細(xì)胞纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(IFT)。IFT表達(dá)異常與腎囊腫的發(fā)生密切相關(guān)。如IFT46是纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)體的核心組成部分，參與所有類型纖毛的形成。Lee等[31]用morpholino 抑制斑馬魚ift46表達(dá)，可引起斑馬魚身體向腹部彎曲彎曲、腎囊腫，心包水腫和視網(wǎng)膜發(fā)育異常等典型的纖毛病表型，其他類型的IFT，如IFT54[32]，IFT57，IFT81和IFT172等功能異常也可導(dǎo)致相同表型的病變[33]。

在常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)中，PKD2基因突變可導(dǎo)致囊性纖維化轉(zhuǎn)膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)激活。CFTR是一個(gè)由1 480個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，主要參與膜內(nèi)外氯離子運(yùn)輸。CFTR介導(dǎo)離子和體液分泌入囊腔，導(dǎo)致囊腫不斷擴(kuò)大。Roxo-Rosa等[34]應(yīng)用斑馬魚枯否氏囊(Kupffer’s vesicle)這一在體模型研究PKD2對(duì)CFTR的作用?？莘袷夏沂且粋€(gè)充滿液體的囊狀器官，內(nèi)襯表達(dá)CFTR和多囊蛋白-2的上皮細(xì)胞。枯否氏囊源自聚集于尾芽處的背部前驅(qū)細(xì)胞(DFCS)，短暫存在于斑馬魚胚胎早期(約14 hpf)，后期發(fā)育成體腔。PKD2 morphant 可使KV體積明顯增大，CTFR抑制劑(ouabain或CFTRinh-172)可以抑制囊腔的擴(kuò)大，而CTFR激動(dòng)劑(forskolin和IBMX)則能使囊腔的體積進(jìn)一步擴(kuò)大，顯示KV囊腔的擴(kuò)大依賴于CTFR的活性。這一研究揭示了CTFR在多囊腎進(jìn)展中的重要作用，同時(shí)提出了多囊腎病的體內(nèi)研究模型，由于斑馬魚胚胎的透明性，可實(shí)時(shí)觀察和測(cè)量囊腔的體積，為多囊腎的研究提供了一個(gè)潛在的工具。

展 望

斑馬魚腎臟的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能與高等哺乳動(dòng)物后腎高度保守，是連接體外細(xì)胞研究模型和傳統(tǒng)的嚙齒類動(dòng)物模型的“橋梁”。斑馬魚已用于正向和反向遺傳學(xué)技術(shù)分析影響腎臟發(fā)育和疾病的基因及其功能，還包括藥物篩選等。在組學(xué)時(shí)代，與腎小球?yàn)V過屏障功能或蛋白尿相關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)。較之小鼠模型，斑馬魚卵的體外受精可人為控制，斑馬魚卵的基因敲除敲入較小鼠易于操作，適合于多重復(fù)雜基因操作以及高通量基因功能篩查，是一種極具前景的動(dòng)物模型，將在腎臟病發(fā)育、疾病研究和治療藥物的篩選中發(fā)揮重要作用。

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(本文編輯 青 松 加 則)

Zebrafish as a genetic system for studying kidney development and kidney diseases

CHENZhaohong，LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

Zebrafish has emerged as a new vertebrate model system for kidney research. Zebrafish kidney is structurally, molecularly and functionally conserved, and the rendering zebrafish is a valuable and relevant model for studying kidney development and diseases. In this paper, the biological characteristics of zebrafish kidney, as well as its potential model for human kidney development and diseases are reviewed. At last, the prospects of zebrafish in functional genomics research are also discussed.

zebrafish nephrogenesis kidney disease podocyte acute kidney disease

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.02.013

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB517606)，國(guó)家自然科學(xué)基金(81470943)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科 國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

2015-12-14