李慧芳　張冬　曲文君　王海霖　劉洋　阿里穆斯　崔箭　董政起

[摘要]該研究根據(jù)生物藥劑學分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS），研究山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素等4種黃酮類中藥有效成分的溶解性和滲透性，并對其進行BCS分類；同時對其吸收機制進行研究。參照《中國藥典》2010年版中溶解度測定方法對4種黃酮類成分進行溶解度的測定，采用體外細胞培養(yǎng)法建立Caco2細胞模型，利用MTT法篩選出合適的給藥濃度進行細胞轉(zhuǎn)運實驗來檢測表觀滲透系數(shù)（Papp）以判斷滲透性，并根據(jù)BCS對其進行分類；采用Caco2細胞模型，選擇高、中、低3組不同濃度化合物進行雙向轉(zhuǎn)運實驗研究吸收機制。實驗表明山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素等具有低溶解性、高滲透性，屬于BCSⅡ類，其中山柰酚為主動轉(zhuǎn)運吸收機制，而橙皮苷、芹菜素、染料木素等為被動吸收。該研究針對中藥黃酮類單體有效成分的特性，對其溶解性及滲透性的評價方法進行了摸索，為進一步完善中藥生物藥劑學分類體系提供了理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]黃酮類中藥有效成分；生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）；吸收機制；溶解性；滲透性

[Abstract]The solubility and permeability on four kinds of flavonoids （kaempferol， hesperidin， apigenin， genistein） were test according to the theory of biopharmaceutics classification system （BCS）， and their absorption mechanism The solubility was investigated by the method in determination of solubility of "Chinese Pharmacopoeia 2010" To detect appearance permeability of compounds mentioned above， the appropriate concentrations were selected by the MTT method in cell transfer experiments in Caco2 cell model， which established by in vitro cell culture method Therefore， these compounds were classified with BCS according to solubility and permeability In addition， to explore absorption mechanisms， the experiments in three different concentrations of compounds in high， medium and low in bidirectional transformation methods in Caco2 cell model contacted The study indicated that all of kaempferol， hesperidin， apigenin， genistein have the characteristics in low solubility and high permeability， which belong to BCSⅡ， and the absorption mechanism of kaempferol was active transportation Whereas， hesperidin， apigenin， genistein were passive transportation In this study， it carried out initial explorations on establishment of determination for solubility and permeability in flavonoids， and provided theoretical reference for further research on BCS in traditional Chinese medicine

[Key words]flavonoids； biopharmaceutics classification system （BCS）； absorption mechanism； solubility； permeability

doi：10.4268/cjcmm20160707

黃酮類化合物（flavonoids）是傳統(tǒng)中藥中所含的一類重要天然有機化合物，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)多種，如黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、二氫黃酮類等[1]，因此其溶解度和滲透性也存在差異[2]?？诜o藥是最方便、廣泛、容易被人們所接受的給藥途徑，符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)給藥方式[3]?？诜o藥后化合物經(jīng)胃腸道吸收進入血液循環(huán)，在化合物吸收過程中溶解性和滲透性是關(guān)鍵[48]，其次是腸道吸收[9]。因此，研究一種中藥有效性成分成藥性時了解其溶解性及滲透性尤為重要，化合物只有被溶解才能透過胃腸道膜，只有良好的滲透性及脂溶性時才能透過脂質(zhì)膜；其次是了解化合物吸收機制，以便更準確地知曉化合物的吸收特性及吸收過程[1012]。

生物藥劑學分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system， BCS）是根據(jù)化合物自身溶解性及腸滲透性的高低對化合物進行分類的一種科學框架或方法。此分類系統(tǒng)基于化學化合物理化性質(zhì)為前提所提出。目前，劉丹[13]，劉維[14]等根據(jù)BCS提出對中藥組分及多成分體系下對中藥生物藥劑學分類理論，但是針對中藥單體成分系統(tǒng)研究其溶解性和滲透性及其吸收機制的研究鮮有人報道。本研究選擇4種極具代表性的黃酮類中藥有效成分，芹菜素（黃酮類）、山柰酚（黃酮醇類）、染料木素（異黃酮類）、橙皮苷（二氫黃酮類），以BCS理論為指導對其進行分類，并研究其吸收機制，為黃酮類中藥有效成分成藥性提供參考。

1材料

高效液相色譜儀（安捷倫公司），電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實業(yè)有限公司），旋渦振蕩器（VORTEX5型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），CO2培養(yǎng)箱（五洲東方科技發(fā)展有限公司），倒置顯微鏡（奧林巴斯公司），超凈臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），熒光/化學發(fā)光分析儀（Thermo公司），微量振蕩器（MM1型，金壇市正基儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），電阻儀（MillcellERS，美國Millipore公司），高壓滅菌罐（上海博訊實業(yè)有限公司）。

山柰酚（批號K131116）、芹菜素（批號K140310）、橙皮苷（批號K141222）均購于西安開來生物工程有限公司；染料木素購于吉林中醫(yī)藥研究所。

甲醇、乙腈（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）；Caco2細胞（北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)所細胞中心）；MEM NEAA（GibcoinvitrogenTM公司）；MEM/EBSS（Hyclone Thermo公司）；胰酶、胎牛血清（Hyclone Thermo公司）；雙抗（UK InvitrogenTM公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；熒光素（天津市光復精細化工廠研究所）。

2方法

21溶解性實驗

211對照品溶液配制分別精密稱取山柰酚、芹菜素、橙皮苷、染料木素對照品21，32，28，58 mg，依次用甲醇溶液定容至25，25，50，50 mL，即得儲備液。

精密吸取山柰酚儲備液稀釋至質(zhì)量濃度分別為0840，0420，0210，0168，0126，0084 mg·L-1的系列對照品溶液；精密吸取芹菜素儲備液稀釋至質(zhì)量濃度分別為0640，0320，0192，0128，0064 mg·L-1的系列對照品溶液；精密吸取橙皮苷儲備液稀釋至質(zhì)量濃度分別為14000，8400，5600，2800，1400，0280 mg·L-1的系列對照品溶液；精密吸取染料木素儲備液稀釋至質(zhì)量濃度分別為11600，5800，2900，1160，0580，0116 mg·L-1的系列對照品溶液。

212溶解性測定方法參照《中國藥典》2010年版中溶解性的測定方法[15]：精密稱取化合物10 mg 置于具塞離心管中，加入5 mL蒸餾水（pH 68），樣品試管置于37 ℃水浴，每5 min振蕩30 s，觀察30 min后于5 000 r·min-1離心10 min，取上清液4 mL于12 000 r·min-1離心10 min，再取上清液過022 μm濾膜，適當稀釋后取樣20 μL于HPLC分析其濃度；設(shè)6個重復。

213溶解性檢測條件采用高效液相法來檢測山柰酚、橙皮苷、芹菜素、染料木素的溶解性，色譜條件如下。

色譜柱均為Agilent TCC18（46 mm×250 mm，5 μm），保護柱均為SEPC18（80 mm×10 mm）；流動相依次為乙腈05%磷酸水溶液38∶62，乙腈水20∶80，乙腈水35∶65，乙腈01%磷酸水溶液36∶64；檢測波長依次為276，283，340，254 nm；流速依次為1，08，08，1 mL·min-1；柱溫均為25 ℃；進樣量均為20 μL。

214標準曲線的建立及方法學考察標準曲線：將211項中的標準溶液，按上述色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）對對照品濃度（X）進行線性回歸，見表1；結(jié)果表明山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素在下述濃度范圍內(nèi)有線性關(guān)系。

方法學考察：取高、中、低3個濃度的山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素對照品溶液，于1 d內(nèi)重復測定5次，考察日內(nèi)精密度，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度，見表2；結(jié)果表明，3個濃度的精密度RSD 均小于2%，說明該分析方法的精密度符合方法學要求。

22滲透性測定方法

在研發(fā)的初期階段，可以采用結(jié)腸腺癌細胞系（Caco2細胞）或人工膜測定藥物的透過，從而預(yù)測藥品從腸腔進入血液的滲透性[16]。本研究采用體外細胞培養(yǎng)法建立Caco2細胞模型，根據(jù)MTT實驗選擇出適合實驗的抑制率小于10%的高、中、低3個濃度的化合物，見表3，并進行轉(zhuǎn)運實驗。

篩選標準為若受試藥物的細胞抑制率<10%，則可作為合適劑量進行實驗。由表3可知，所選濃度的受試化合物的細胞抑制率均小于10%，則均可作為適宜初始濃度進行實驗。

培養(yǎng)21 d后，將細胞從培養(yǎng)箱中取出，吸去小室內(nèi)外的培養(yǎng)液，用預(yù)熱至37 ℃的Hank′s液清洗細胞2次，最后一次放置在培養(yǎng)箱中孵育20 min。取出細胞，測量并記錄TEER。在細胞絨毛面（apical，AP）側(cè)加入不同濃度的受試化合物，基底面（basolateral，BL）加入新鮮的Hank′s液，記錄時間，在加入化合物后的第15，30，60，90，120 min分別從BL側(cè)吸取100 μL的液體樣品于15 mL離心管中并補充同體積的Hank′s液，并對100 μL樣品于HPLC測定含量。2 h后，再次測量并記錄TEER。

TEER =ΔR×A

其中，ΔR為實際電阻，A為轉(zhuǎn)運膜面積，為112 cm2。

根據(jù)轉(zhuǎn)運實驗的結(jié)果計算Papp，并判斷化合物的滲透性。

Papp=（dQ/dt）/（A×C0）

其中，Papp為表觀滲透系數(shù)（cm·s-1）；dQ/dt為單位時間化合物轉(zhuǎn)運量（μg·s-1）；C0為受試化合物的初始濃度（mg·L-1），見表3。

23吸收機制研究

利用Caco2細胞模型，選擇高、中、低3組不同濃度化合物進行雙向轉(zhuǎn)運實驗，將各濃度的化合物溶液05 mL加到細胞AP側(cè)作為供給池，同時BL側(cè)加入空白的Hank′s平衡鹽溶液15 mL作為接受池，分別在15，30，60，90，120 min取BL側(cè)溶液100 μL于HPLC分析其含量，觀察4種黃酮類化合物從細胞AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運。另外，將各濃度的化合物溶液15 mL加到BL側(cè)作為供給池，同時AP側(cè)加入空白Hank′s平衡鹽溶液05 mL作為接受池，分別在上述取樣時間點取BL側(cè)溶液100 μL于HPLC分析其含量，觀察其從BL側(cè)到細胞AP側(cè)的轉(zhuǎn)運。

3結(jié)果與分析

31溶解度及溶解性分類

生物藥劑學分類系統(tǒng)規(guī)定高溶解性的藥物是指在37 ℃下，pH在1～75，劑量與溶解度的比值小于250 mL的藥物。將劑量（mg）除以溶解度（g·L-1）得到的比值（以體積mL為單位）與FDA的標準250 mL相比，即可判斷藥物溶解度的高低。由于BCS理論之前均是針對化學藥，中藥沒有明確的給藥劑量，所以根據(jù)《中國藥典》2010年版中的近似溶解度的判定方法來判定藥物的溶解性，認為凡水溶解度高于001 g·mL-1，即達到略溶標準的都是溶解性高的藥物。

溶解度（S）是藥品的一種物理性質(zhì)。根據(jù)《中國藥典》2010年版中規(guī)定，將藥品的近似溶解度以下列名詞來表示，如0000 1 g·mL-1

32滲透性判斷

FDA推薦的測定滲透性的方法中以Caco2細胞判斷化合物吸收難易的一般標準為[1718]：Papp<10×10-6 cm·s-1為吸收較差的化合物，吸收率在0%～20%；Papp在10×10-6～10×10-6 cm·s-1為吸收中等的化合物，吸收率在20%～70%；Papp>10×10-6 cm·s-1吸收較好的化合物，吸收率在70%～100%。本文采用體外細胞培養(yǎng)法建立Caco2細胞模型，利用MTT法篩選出合適的給藥濃度進行細胞轉(zhuǎn)運實驗，在規(guī)定時間點吸取BL側(cè)溶液100 μL于HPLC分析其含量，根據(jù)轉(zhuǎn)運實驗的結(jié)果計算Papp，見表4。與內(nèi)標物美托洛爾（1×10-6 cm·s-1）進行對比判斷化合物的滲透性，結(jié)果顯示山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素的Papp均高于內(nèi)標物美托洛爾，表明上述4種黃酮類有效物質(zhì)均有高滲透性。

33BCS分類

根據(jù)BCS分類系統(tǒng)，Ⅰ類，高溶解性、高滲透性；Ⅱ類，低溶解性、高滲透性；Ⅲ類，高溶解性、低滲透性；Ⅳ類，低溶解性、低滲透性[56]。判斷上述4種黃酮類化合物的分類，均屬于Ⅱ類。

34吸收機制

利用Caco2細胞模型，選擇高、中、低3組不同濃度化合物進行雙向轉(zhuǎn)運實驗，即HPLC分別測AP→BL側(cè)與BL→AP側(cè)轉(zhuǎn)運量，見圖1，2。考察不同時間點及不同的給藥濃度時兩側(cè)轉(zhuǎn)運量和的Papp的變化規(guī)律，見圖3，分析其吸收機制。

根據(jù)圖1，2可知，山柰酚隨著時間增加，3濃度轉(zhuǎn)運量不斷增加，呈現(xiàn)時間依賴性；橙皮苷、芹菜素及染料木素隨著時間增加，3濃度轉(zhuǎn)運量不斷增加，沒有明顯的飽和趨勢。

根據(jù)圖3可知，Papp隨著給藥濃度的增加在AP→BL方向和BL→AP方向均呈現(xiàn)出減小的趨勢（P<005）。由此可見，山柰酚在吸收過程（AP→BL）中有濃度依賴性，可能受到轉(zhuǎn)運載體介導，主要以主動轉(zhuǎn)運的方式轉(zhuǎn)運；而在分泌過程（BL→AP）中，無濃度依賴性。此外，3個濃度的表觀滲透率Pratio均接近1且小于15（Pratio為Papp BL→AP與Papp AP→BL的比值），沒有明顯的方向性，不存在外排蛋白介導，所以山柰酚在人體內(nèi)主要以主動轉(zhuǎn)運的方式吸收。

橙皮苷、芹菜素及染料木素3種黃酮類化合物的高、中、低3濃度的橙皮苷Pratio均接近1，雙向轉(zhuǎn)運結(jié)果顯示無明顯的方向性，認為不存在外排蛋白介導，所以橙皮苷在人體內(nèi)主要以被動轉(zhuǎn)運的方式吸收。

4討論

由于FDA指導原則中是針對新藥注冊申報的要求，而本文所選的模型藥物僅僅是對其成藥性進行初步判斷，暫時無模型藥物的臨床使用劑量作為參考，所以本研究溶解性的判斷方法并未選用劑量參數(shù)進行折算。另一方面，現(xiàn)行BCS經(jīng)典理論是主要針對化學化合物，大部分為可分解的離子型化合物，因此不論是給藥劑量還是溶劑的pH都規(guī)定了明確的標準。但是，目前中藥BCS分類中判斷各類天然產(chǎn)物及其單體的溶解性高低沒有明確標準，因此本文選擇根據(jù)《中國藥典》2010年版中的近似溶解度的判定方法來初步判斷中藥單體有效成分的溶解性。侯成波等[19]分別在pH 10，40，74的緩沖鹽中進行葛根素的溶解度實驗，結(jié)果表明不同pH背景下葛根素溶解度不同，其在pH 74時其溶解度最高。但目前尚未報道對中藥黃酮類在不同濃度下的溶解度的研究。因此參考FDA工業(yè)指導原則中規(guī)定，需要在不同pH條件下的溶解度數(shù)據(jù)以準確描述化合物的pH溶解度曲線，如當化合物的pKa在3～5時，溶解度可在pH=pKa，pH=pKa+1，pH=pKa-1，pH=1，175條件下進行測定[6]。本實驗在探索山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素等在不同pH緩沖鹽的溶解度時首先在pH 68水溶液下檢測，在后續(xù)的研究中考慮不同pH下的溶解度。

FDA推薦的測定滲透性的方法有人體化合物動力學數(shù)據(jù)、人體腸道灌流實驗、原位動物模型數(shù)據(jù)或有效的單層細胞培養(yǎng)[6]。FDA規(guī)定，高滲透性的化合物是指在胃腸道穩(wěn)定的情況下，能夠達到90%以上可被吸收的化合物，此數(shù)值可以間接地通過化合物在人體內(nèi)的吸收程度來獲得，即指相當于給藥劑量被吸收的分數(shù)，而不是指系統(tǒng)的生物利用度。大部分化學化合物（如絕對生物利用度大于90%）利用一種方法就足以判斷滲透性類別，但有些化合物不能用一種方法來判斷滲透性，這時最好用2種方法來進行驗證。本文選擇以Caco2單層細胞透過性來判斷藥物的滲透性，便捷、快速且準確，適合藥物的早期成藥性評價。經(jīng)初步判斷成藥性好的候選藥物，如進一步進行臨床前研究，可考慮增加在體和離體動物實驗進行多角度的滲透性評價，為后期的臨床試驗奠定基礎(chǔ)。

山柰酚、橙皮苷、芹菜素及染料木素溶解度和滲透性實驗結(jié)果表明其有低溶解性，高滲透性特質(zhì)，屬于BCSⅡ類。一般來說，BCSⅡ類化合物（如環(huán)孢霉素、灰黃霉素、依曲康唑）的生物利用度受其溶解度的限制，即使較小的溶出速率的增加都會使生物利用度大幅提高。根據(jù)NoyesWhitney方程，影響化合物溶出速率的因素有擴散系數(shù)、有效表面積、擴散層的厚度、溶解度、溶解化合物的量及溶出介質(zhì)的體積。因此在上述4種黃酮類有效成分成藥性研究中通過處方前研究和處方設(shè)計可提高化合物溶解度，增加其有效表面積，從而提高化合物的溶出速率，改善其溶解性；常用的方法有晶型修飾，減小粒徑，自乳化和制成無定型化合物。此外，當某化合物的Papp AP→BL與Papp BL→AP接近時，該化合物以被動擴散方式轉(zhuǎn)運；Papp AP→BL明顯大于Papp BL→AP時被小腸A側(cè)膜的轉(zhuǎn)運蛋白所轉(zhuǎn)運；Papp BL→AP明顯大于Papp AP→BL時，則被小腸A側(cè)膜的外向型轉(zhuǎn)運蛋白所外排。因此，山柰酚的吸收機制是主動轉(zhuǎn)運；橙皮苷、芹菜素、染料木素的吸收機制是被動轉(zhuǎn)運。

中藥的口服使用是中醫(yī)臨床的主要手段，中藥發(fā)揮療效的機制，多數(shù)情況下與中藥成分胃腸道吸收后，在機體相關(guān)部位產(chǎn)生作用有關(guān)?；瘜W藥的BCS在很大程度上推動了新藥發(fā)現(xiàn)的進程，提高了新藥開發(fā)的效率。借鑒化藥發(fā)展經(jīng)驗，本課題組以BCS為理論指導，已初步對4種黃酮類化合物進行生物藥劑學分類研究，并分析了其吸收機制，為其成藥性提供了理論依據(jù)。但是建立黃酮類有效成分的BCS，在后續(xù)的工作中不僅需要完善黃酮類化合物的種類還需改善檢測溶解性及滲透性實驗?zāi)Ｐ?，并為建立中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)提供參考依據(jù)。

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[責任編輯孔晶晶]