曲衛(wèi)玲　曹媛　劉煥蘭　童玲　范?！s福

[摘要]采用iTRAQ技術(shù)研究瓊玉膏干預(yù)衰老大鼠模型的下丘腦蛋白，尋找候選靶蛋白，探索瓊玉膏延緩衰老的作用機(jī)制。結(jié)果表明，瓊玉膏可以提高大鼠血清GSHPx及肝臟SOD活力。iTRAQ技術(shù)鑒定到的總蛋白為3 522個(gè)，F(xiàn)DR<1%。通過數(shù)據(jù)分析，鑒定出瓊玉膏組與模型組比較，具有295種差異蛋白；模型組與空白組比較，具有20種差異蛋白；其中與空白組相比，模型組中下調(diào)而瓊玉膏組中上調(diào)的蛋白有14種。在瓊玉膏組和模型組的295種差異蛋白中，差異倍數(shù)≥130的差異蛋白有40種，最高為147。查閱文獻(xiàn)及基因功能檢索，篩選出瓊玉膏延緩衰老的候選靶蛋白12種：ST18，Ptprc，PSMB8，INPP4B，Shc3，Pik3r1，PIP5K1C，Nampt，Rasgrp2，Asah2，Pdpk1，Map2k7。Western blot法檢測(cè)下丘腦炎癥通路NFκB蛋白，模型組（096）相對(duì)空白組（085）表達(dá)量升高；而瓊玉膏組（089）相對(duì)模型組則下降。QPCR檢測(cè)PIP5K1C，Ptprc等與炎癥相關(guān)的候選靶蛋白，與空白組相比，模型組中mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中則顯著升高（P<001），與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析一致。瓊玉膏可能通過調(diào)節(jié)下丘腦炎性反應(yīng)而延緩衰老的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]瓊玉膏；延緩衰老；候選靶蛋白；下丘腦；iTRAQ；NFκB

[Abstract]To explore the associated proteins of the hypothalamus in aging rat models with intervention by Qiongyugao（QYG） based on iTRAQ technology， find out the target protein candidates and investigate the mechanism of delaying aging for Qiongyugao The results showed that Qiongyugao increased GSHPx activity in serum and SOD activity in liver； the total protein count identified by iTRAQ was 3 522， FDR<1% There were 20 kinds of differential proteins between the blank group and model group； there were 295 kinds of differential proteins between model group and QYG group， and 40 kinds of them had a difference multiple ≥130 （the maximum value was 147） Compared with blank group， there were 14 kinds of proteins that were downregulated in model group and upregulated in QYG group Combined with literature search and gene function search， 12 kinds of target protein candidates were screened out ： ST18， Ptprc， PSMB8， INPP4B， Shc3， Pik3r1， PIP5K1C， Nampt， Rasgrp2， Asah2， Pdpk1， and Map2k7 The expression of nuclear factorkappa B （NFκB） in the hypothalamic inflammatory pathway was detected by Western blot and the results showed that its expression level in model group（096） was higher than that in control group（085）， while its expression level in QYG group（089） was lower than that in model group QPCR results showed that the relative mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in model group were significantly lower than those in blank group（P<001）； while compared with the model group， the mRNA expression levels of PIP5K1C and Ptprc in QYG group were significantly increased（P<001） This result was consistent with proteomics data QYG may delay aging by regulating hypothalamic inflammatory reaction

[Key words]Qiongyugao（QYG）； antiaging； target protein candidates； hypothalamus； iTRAQ； NFκB

doi：10.4268/cjcmm20160724

瓊玉膏作為一劑經(jīng)典養(yǎng)生方，曾被清宮皇帝作為日用養(yǎng)生品服用；現(xiàn)今應(yīng)用瓊玉膏治療虛勞、癌癥的效果也得到認(rèn)可。瓊玉膏組方簡(jiǎn)單，僅生地、人參、茯苓和蜂蜜4味，但配伍精良，補(bǔ)陰而不忘扶陽(yáng)、益氣而不忘育陰，既可治病也可養(yǎng)生，有良好的改善免疫、延緩衰老的作用。但是目前關(guān)于瓊玉膏的作用機(jī)制少有研究，本課題研究希望能有助于闡明瓊玉膏延緩衰老機(jī)制，有利于瓊玉膏的研發(fā)和應(yīng)用。

1材料

雄性SD大鼠，42只，日齡180～200 d，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）20130034。

自制瓊玉膏（蜂蜜，北京同仁堂有限公司；生地黃，產(chǎn)地河南，北京冠城藥業(yè)有限公司；人參，產(chǎn)地吉林，北京同仁堂有限公司；茯苓，產(chǎn)地云南，廣東眾康中藥飲片有限公司）； D半乳糖（美國(guó)Amresco公司）；尿素（美國(guó)GibcoBRL公司，01M00491V）；二硫素糖醇（美國(guó)Promega公司，R21041092）；碘乙酰胺IAA（美國(guó)Promega公司，NI174659）；測(cè)序級(jí)胰蛋白酶Trypsin（美國(guó)Promega公司，0000142423）；SDS（美國(guó)Sigma公司，L5750）；三氟乙酸TFA（美國(guó)Sigma公司，A0329207）；TMT 6標(biāo)試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司，PL208420）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司，10061200）；三乙基碳酸氫銨TEAB（巴拉圭圣克魯斯公司，NH174658）；高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）（RP1201），Recombinant DNase I （RNasefree）（2270A），Recombinant Ribonuclease Inhibitor（2313A），Oligo d（T）18 Primer（3806），Random Primer [Hexadeoxyribonucleotide mixture；pd（N）6]（3801），Reverse Transcriptase MMLV（RNase H）（2641A），dNTP Mixture（T4019）均來自日本takara公司；SYBR GREEN（日本ToYoBo公司，QPK201）；PMSF（100 mmol，碧云天生物技術(shù)，ST506）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)，P0013B）；pageruler prestained protein ladde（美國(guó)賽默飛公司，26619）；βACTIN抗體肌動(dòng)蛋白（BM0627）；羊抗兔IgG HRP（BA1054）均來自博士德公司；丙烯酰胺Acrylamide（0341），N，N亞甲基甲叉雙丙烯酰胺（methylenebisacrylamide，110269），Tris Base（0497），SDS（L5750），過硫酸銨（ammonium peroxodisulfate，0488），甘氨酸（glycine，0167），聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20，Tween20，0777）均來自美國(guó)Amresco公司。

冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；HClass超高壓液相色譜和NanoAcuity超高壓納升級(jí)液相色譜（Waters公司）；Q Exative質(zhì)譜儀（Thermo Scientific公司）；UMAX Powerlook 2100XLUSB掃描儀；IKA振蕩器；恒溫加熱塊（鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；冷凍臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX100手掌式離心機(jī)（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋（長(zhǎng)安科學(xué)儀器）；A100PCR儀（Long Gene）；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（BioRAD）；JY200C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；7S2脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5200凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）。

2方法

21動(dòng)物分組及造模方法

6～7月齡健康雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：空白對(duì)照組、衰老模型組和瓊玉膏給藥組，每組14只。除空白組外，其余2組每天腹腔注射D半乳糖300 mg·kg-1，連續(xù)造模6周，空白對(duì)照組腹腔注射等劑量生理鹽水。同時(shí)，瓊玉膏給藥組每天灌胃瓊玉膏0005 83 mL·g-1，衰老模型組和空白對(duì)照組灌胃等劑量生理鹽水。給藥結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血（3組各取到9例），取肝臟組織（模型組取到7例，其余2組9例），進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試。

22同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量（iTRAQ）

3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取下丘腦，每組2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)6個(gè)樣本，進(jìn)行12標(biāo)iTRAQ蛋白組檢測(cè)分析：①提取蛋白質(zhì)并定量；②蛋白質(zhì)酶解；③肽段標(biāo)記；④標(biāo)記肽段除鹽；⑤高pH反向液相色譜對(duì)標(biāo)記肽段進(jìn)行分離；⑥對(duì)標(biāo)記肽段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)；⑦基于質(zhì)譜的定性定量分析。

23QPCR驗(yàn)證

檢測(cè)BLAB/c nu/nu下丘腦對(duì)差異蛋白表達(dá)量的關(guān)系，每組4個(gè)樣本重復(fù)：①引物設(shè)計(jì)；②總RNA的提取與檢測(cè)；③逆轉(zhuǎn)錄（RT）；④QPCR反應(yīng)體系；⑤跑膠驗(yàn)證。

24Western blot驗(yàn)證

檢測(cè)BLAB/c nu/nu下丘腦差異蛋白的表達(dá)情況，每組3個(gè)樣本重復(fù)：①蛋白提取與含量測(cè)定；②電泳；③轉(zhuǎn)膜；④封閉、孵育；⑤顯影；⑥灰度檢測(cè)。

25統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS 190統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示，用單因素方差分析，t檢驗(yàn)等進(jìn)行組間比較。

3結(jié)果

31衰老模型評(píng)價(jià)

大鼠出現(xiàn)毛色枯槁無光、皮膚彈性差、精神萎靡、倦怠嗜睡、明顯減少進(jìn)食、形體瘦弱、行動(dòng)遲緩等衰老體征；取血清和肝臟組織進(jìn)行抗氧化能力測(cè)試。

311血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）檢測(cè)與空白組比較，模型組大鼠血清GSHPx活力值明顯下降，而瓊玉膏組可以提升其活力值（但未及空白組水平），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

因此，從模型組的動(dòng)物形態(tài)學(xué)觀察及血清GSHPx，肝臟SOD活力均呈下降趨勢(shì)來看，衰老模型造模成功，且初步判斷瓊玉膏具有抗氧化性。

32差異表達(dá)蛋白

比較空白組、瓊玉膏組和模型組中下丘腦蛋白質(zhì)含量，2組樣本中各個(gè)蛋白表達(dá)量的比值，大于12或者小于083就認(rèn)為是差異蛋白，采用分組t檢驗(yàn)，P<005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒定出瓊玉膏組與模型組比較，具有295種差異蛋白；瓊玉膏組與空白組比較，具有96種差異蛋白；模型組與空白組比較，具有20種差異蛋白。

與空白組相比，在模型組中下降而瓊玉膏組可以上調(diào)的差異蛋白共有14個(gè)：細(xì)胞色素c氧化酶多肽VIc2（Cox6c2），中性神經(jīng)酰胺酶（Asah2），植烷酸輔酶A 羥化酶相互作用類蛋白（Phyhipl），尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt），尾錨定蛋白插入受體WRB（Wrb ），O甘露糖β1，4N乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶（Pomgnt2），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Stat5b），脂酰CoA合成酶（Aacs），特定微管伴侶蛋白E（Tbce），3磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1（Pdpk1），雙特異性作用蛋白激酶7（Map2k7），RAS脒基釋放蛋白2（Rasgrp2），SHC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Shc3），細(xì)胞周期素G蛋白（Gak）。

對(duì)瓊玉膏組與模型組相比的295種差異蛋白中進(jìn)一步篩選，差異倍數(shù)≥130的差異蛋白有40種（最高為147）。

結(jié)合文獻(xiàn)及基因功能檢索，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出與衰老可能相關(guān)的差異蛋白，見表3。

33WB檢測(cè)

運(yùn)用WB法檢測(cè)衰老相關(guān)通路NFκB蛋白表達(dá)量情況，光密度測(cè)定結(jié)果見表4，圖1，2。與空白組比較，模型組NFκB通路被激活，蛋白表達(dá)量升高；與模型組比較，瓊玉膏組NFκB蛋白的表達(dá)量降低。

34QPCR檢測(cè)

QPCR檢測(cè)BLAB/c nu/nu下丘腦PIP5K1C，Ptprc mRNA表達(dá)量，見圖3。從電泳圖可以看出提取的RNA含量合格，沒有被污染。

通過計(jì)算結(jié)果顯示，運(yùn)用瓊玉膏后PIP5K1C，Ptprc mRNA相對(duì)表達(dá)量有差異。經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，與空白組相比，模型組中PIP5K1C mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中PIP5K1C mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<001）；同樣，與空白組相比，模型組中Ptprc mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P<001），而瓊玉膏組中Ptprc mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P<001），見表5，圖4。通過凝膠電泳驗(yàn)證，PCR引物設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)出結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

4討論

衰老原因非常復(fù)雜，涉及面廣，有關(guān)衰老的學(xué)

41瓊玉膏對(duì)D半乳糖致衰大鼠的抗氧化能力

機(jī)體對(duì)自由基的清除能力是目前運(yùn)用較多的評(píng)價(jià)衰老的指標(biāo)。本課題對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠抗氧化能力研究表明，瓊玉膏可以提高大鼠血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）及肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活力，從而提升總抗氧化能力，清除自由基，延緩衰老。

42瓊玉膏延緩衰老的候選靶蛋白篩選

綜合比較空白組、模型組和瓊玉膏組的下丘腦蛋白，結(jié)合查閱相關(guān)研究文獻(xiàn)及基因功能，進(jìn)一步篩選出12種與衰老相關(guān)的差異蛋白：腫瘤抑制蛋白18（ST18）、酪氨酸激酶C型受體（Ptprc）、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白7抗體（PSMB8）、Ⅱ型多磷酸肌醇4磷酸酶（INPP4B）、SHC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Shc3）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（Pik3r1）、磷脂酰肌醇4磷酸5激酶（PIP5K1C）、尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt）、RAS脒基釋放蛋白2（Rasgrp2）、中性神經(jīng)酰胺酶（Asah2）、3磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1（Pdpk1）、雙特異性作用蛋白激酶7（Map2k7）。這些差異蛋白與代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)，多參與影響細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等通路[25]，與衰老相關(guān)。

43瓊玉膏延緩衰老的炎癥通路機(jī)制

通過QPCR驗(yàn)證篩選差異蛋白中的PIP5K1C，Ptprc發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，2個(gè)差異蛋白均在模型組中下調(diào)，而在瓊玉膏組中又有上調(diào)趨勢(shì)，這與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。PIP5K1是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生磷脂肌醇PIP2的重要蛋白，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，研究人員發(fā)現(xiàn)該蛋白在中性粒細(xì)胞遷移中起重要作用：缺失PIP5K1C的中性粒細(xì)胞穿過血管壁到達(dá)炎癥部位的能力明顯下降[6]。Ptprc是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的遺傳生物標(biāo)志[7]。有研究資料表明，ST18，Nampt等也能夠調(diào)節(jié)免疫功能及促進(jìn)炎癥反應(yīng)[89]。半乳糖誘導(dǎo)PIP5K1C，Ptprc等蛋白表達(dá)異常，引起機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥通路NFκB發(fā)生改變。NFκB是機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激的相關(guān)通路，是機(jī)體內(nèi)炎癥激活的標(biāo)志。近年有研究表明，下丘腦NFκB通路炎癥是導(dǎo)致衰老的重要原因[10]。而瓊玉膏可以糾正差異蛋白異常表達(dá)量，調(diào)節(jié)NFκB通路。

因此，課題組將在此研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其他候選靶蛋白進(jìn)行篩選，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究瓊玉膏改變下丘腦炎性衰老的具體機(jī)制。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]