徐迎迅　楊　成

1 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室　煙臺　264003；2 菏澤市立醫(yī)院分院普外科

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miRNA-100對胃癌細胞侵襲遷移力及放射敏感性的影響

徐迎迅1,2楊成1

1 濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室煙臺264003；2 菏澤市立醫(yī)院分院普外科

【摘要】目的探究miRNA-100對胃癌細胞NCI-N87侵襲轉(zhuǎn)移能力及放射敏感性的影響。方法實時熒光定量PCR定量檢測miR-100在NCI-N87細胞中的表達量?？寺⌒纬蓪嶒?、MTT實驗、Transwell侵襲實驗、流式細胞儀、細胞劃痕實驗及Western blot檢測miR-100對胃癌細胞NCI-N87放射敏感性、增殖、侵襲、凋亡、遷移及侵襲相關蛋白的表達的影響。結(jié)果實時熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-100在NCI-N87細胞中的表達明顯改變；克隆形成實驗、MTT實驗、Transwell侵襲實驗、流式細胞儀、細胞劃痕實驗及Western blot結(jié)果證實miR-100可抑制NCI-N87細胞增殖、侵襲、遷移及侵襲相關蛋白的表達，促進細胞凋亡，提高其輻射敏感性。結(jié)論miR-100可抑制NCI-N87細胞的生長增殖侵襲遷移能力，促進其凋亡，且提高其輻射敏感性。

【關鍵詞】miR-100；NCI-N87；放射敏感性；侵襲；轉(zhuǎn)移

胃癌是威脅我國人民生命健康的最主要惡性腫瘤之一，雖然近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但仍分別居惡性腫瘤的第2位和第3位[1，2]。雖然傳統(tǒng)意義上手術(shù)治療的規(guī)范化及新型抗腫瘤藥物的研發(fā)對胃癌的治療取得了長足的進步，但對于大部分可手術(shù)的局部進展期胃癌或者不可根治的轉(zhuǎn)移性胃癌的診治仍有許多疑難點困擾我們，術(shù)后五年生存率僅30%左右。其臨床生理病理改變復雜多變且機理尚未探明。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)生的、長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過調(diào)節(jié)mRNA的翻譯來調(diào)控靶基因的表達,通過調(diào)控多種通路的靶基因參與多種生物學信號通路的調(diào)節(jié)[3，4]。腫瘤細胞的放射敏感性與蛋白編碼基因的異常表達、包括miRNA在內(nèi)的非編碼RNA的調(diào)節(jié)密切相關[5，6]本實驗通過克隆形成實驗、MTT實驗、Transwell侵襲實驗、流式細胞儀、細胞劃痕實驗及Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-100模擬體、抑制劑及陰性對照后的胃癌細胞侵襲遷移能力及輻射敏感性的變化。

1.1材料和試劑人胃癌細胞系NCI-N87購自中國科學院上海細胞庫并由本實驗室冰凍保存，生長培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)DMEM的培養(yǎng)基。按轉(zhuǎn)染條件不同分為mimimc、inhibitor 和nc組。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Thermo公司；miR-100模擬體、抑制劑及陰性對照劑由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；MMP-2、MMP-9及GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染取密度適宜對數(shù)生長期細胞，無酶EP管以DMEM 培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染試劑及miR-100合成產(chǎn)物，5 min內(nèi)混勻，靜置20 min,細胞無血清DMEM培養(yǎng)基換液，加轉(zhuǎn)染復合體，4～6 h換含10%血清DMEM 培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2Real-time PCR胰酶消化收集細胞，加TRIzol裂解提取RNA，測濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA，實時熒光定量PCR檢測miR-100相對表達量。以2^-△△CT表示腫瘤細胞轉(zhuǎn)染miR-100mimic、inhibitor后表達量相對于轉(zhuǎn)染陰性對照后miR-100表達量的變化倍數(shù)。

1.2.3MTT實驗對數(shù)生長期細胞1×103～4個細胞/孔接種于 96孔板，設5個平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入 MTT溶液 100 μL，37℃ 4 h，每孔加200 μL DMSO，震蕩10 min，測 490 nm處OD值。計算各組細胞的增值能力。

1.2.4克隆形成實驗以200、300、3 000、5 000、8 000細胞數(shù)接種六孔板，分別給予0、2、4、6、8 Gy輻射處理，37 ℃、5% CO2孵育2周，洗滌，固定，Giemsa 染色，計數(shù)，計算克隆形成率及輻射增敏比。

1.2.5細胞凋亡檢測收集細胞培養(yǎng)液及細胞，離心，染色緩沖液重懸細胞，避光加入PI和Annexin V試劑，室溫孵育 15～30 min，于流式測定管中上機檢測分析。

1.2.6Western blot提取細胞蛋白，繪制標準曲線，40 μg上樣量上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，曝光，結(jié)果分析。

1.2.7Transwell侵襲實驗實驗前Matrigel基質(zhì)膠4℃預冷成液態(tài)，槍頭預冷，DMEM培養(yǎng)基1∶5稀釋Matrigel基質(zhì)膠，每小室50 μL，37℃ 1 h，0.5% BSA培養(yǎng)基重懸細胞至5×105/ml，每孔100 μL，500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入24孔板下室，培養(yǎng)24 h，洗滌2遍，甲醇固定 30 min，Giemsa染液染色 30 min，棉簽擦去上層基質(zhì)膠和未遷移的細胞，細胞計數(shù)。

1.2.8細胞劃痕實驗細胞生長至接近飽時用無菌的 200 μL槍頭于標記位置劃出等寬的直線劃痕，清洗，無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察劃痕的寬度,拍照對比分析。

2結(jié)果

圖1細胞轉(zhuǎn)染 miR-100 mimics，inhibitor圖2miR-100對細胞增殖能力的影響

2.1實時熒光定量PCR驗證 NCI-N87細胞中miR-100轉(zhuǎn)染效果如圖1所示：NCI-N87細胞轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細胞組miR-100的相對表達量明顯高于轉(zhuǎn)染 miR-100 NC組，兩組對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；相反，NCI-N87細胞轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor組miR-100的相對表達量明顯低于轉(zhuǎn)染miR-100 NC細胞組，P<0.01，兩組對比差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，化學合成的成熟 miR-100可以有效的轉(zhuǎn)染入NCI-N87細胞，能顯著提高或降低轉(zhuǎn)染細胞中miR-100的表達量。

及陰性對照后miR-100相對表達量

2.2miR-100抑制NCI-N87細胞增殖我們通過MTT實驗驗證轉(zhuǎn)染miR-100對胃癌增殖能力的影響。實驗結(jié)果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染 NC細胞組(0.862±0.043)相比，轉(zhuǎn)染 miR-100 mimic細胞組(0.685±0.023)的增殖力明顯下降，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義；而轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor組(1.112±0.059)的增殖力明顯提高，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 miR-100降低NCI-N87細胞侵襲遷移能力我們通過劃痕實驗、Transwell、及western blot從實驗現(xiàn)象及基因?qū)用嫔向炞CmiR-100對胃癌細胞侵襲遷移能力的影響。如圖3所示，NCI-N87細胞劃痕后 48 h miR-100 mimic細胞組劃痕條帶愈合速度明顯慢于 NC組；相反，細胞轉(zhuǎn)染 miR-34a inhibitor細胞組的劃痕條帶愈合速度則快于NC組(圖3 A)。轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細胞組(14.67±2.03)平均每視野(×20)穿出小室的細胞數(shù)與NC細胞組(23.67±1.76)相比顯著減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染 miR-100 inhibitor (31.67±1.67)組顯示每視野(×20)穿出小室的細胞數(shù)相對增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(圖3B)。此外，Western blots對MMP-2、MMP-9的蛋白水平變化進行檢測發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9的表達水平與 miR-100的表達量呈負相關(圖3 C)。

2.4miR-100促進NCI-N87細胞凋亡我們通過流式細胞術(shù)檢測miR-100對胃癌細胞凋亡的影響，結(jié)果如圖4所示，與對照組(13.95±0.72)相比，轉(zhuǎn)染miR-100 mimic細胞組(20.05±1.23)的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相反，轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor細胞組(8.60±0.63)的凋亡率則相應的減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.5miR-100提高NCI-N87細胞克隆輻射敏感性克隆形成實驗結(jié)果顯示，相較于陰性對照組而言，細胞轉(zhuǎn)染miR-100mimic后輻射敏感性顯著增強；而轉(zhuǎn)染miR-100 inhibitor后輻射敏感性顯著降低，見表1。

表1　miR-100對NCI-N87細胞輻射敏感性的影響

注：D0為平均致死量；Dq 為準閥劑量；SER為輻射增敏比。

3討論

miRNA在細胞分裂、增殖、分化、凋亡以及癌癥形成中發(fā)揮著巨大的作用。miRNA測定相關研究揭示不同類型癌癥中miRNA水平異于正常,進一步研究證明相關的異常miRNA基因位于癌癥相關的畸變基因組。大約有30%的蛋白編碼基因是由miRNA調(diào)控的[7]。它可以通過誘導RISC綁定到目標基因來達到阻止或延遲靶基因翻譯的作用[8]。許多研究探討過胃癌中miRNA的表達譜，在彌散型胃癌中miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-143、miR-145以及miR-133a均是高表達的[9]。與正常組織相比，在未分化胃癌組織中miR-34b、miR-34c及miR-128a是顯著上調(diào)的而miR-128b、miR-129及miR-148表達量顯著降低[10]。這些在腫瘤組織中異常表達的miRNA可能作為腫瘤的預后指標或者診斷生物標志物以區(qū)分與正常組織。以上研究都證明miRNA參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展并有可能成為一個新的診斷標準和治療靶點。

對于胃癌來講，臨床多手段多學科結(jié)合治療已成為一種共識，而放射治療是腫瘤治療中的重要手段之一。放射治療目的在于控制疾病進展，縮小病灶范圍，為手術(shù)創(chuàng)造良好條件。然而由于放射抵抗及腫瘤周邊危及器官耐受量低限制劑量增大等因素往往使放射治療收效甚微甚至失敗，因此，如何克服輻射抵抗，有效的增強胃癌放療敏感性，提高放射治療療效，并尋找新的治療突破點，對于改善患者生存與生活質(zhì)量具有重要意義。有研究表明，胃癌細胞的放射敏感性與miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)密切相關。miRNA可通過調(diào)控腫瘤細胞的EMT來影響腫瘤細胞特性，這種機制可能會在很大程度上影響胃癌的放射敏感性。此外，外泌體介導的miRNA表達水平的變化也發(fā)揮著重要作用。

miR-451和miR-221/222 的過表達能夠增強胃癌細胞AGS7901的輻射敏感性通過靶向結(jié)合MIF和PTEN[11]。對miRNA及涉及腫瘤放射敏感性相關通路研究的深入為現(xiàn)有的放射治療的改進和發(fā)展提供了理論支持和技術(shù)支持，但由于放射治療涉及面廣，機制復雜，目前關于提高胃癌細胞放射治療的方法仍較局限，miRNA調(diào)節(jié)胃癌細胞輻射敏感性的具體機制仍需深入探究。

本研究通過將miR-100模擬體、抑制劑及陰性對照劑轉(zhuǎn)染入胃癌細胞中人為調(diào)節(jié)miR-100的表達來觀察miR-100對細胞放射敏感性、增殖、侵襲、凋亡、遷移及侵襲相關蛋白的表達的影響。結(jié)果證實miR-100可抑制NCI-N87細胞的生長，促進其凋亡，并且抑制NCI-N87細胞的侵襲遷移能力，提高其輻射敏感性。目前關于miR-100對胃癌發(fā)生發(fā)展及治療的研究仍處于初級階段，從基因水平探索miRNA對腫瘤侵襲遷移力及輻射敏感性的影響為腫瘤的臨床治療提供了新的切入點。

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Effect of miR-100 on the invasion,migration and radiosensitivity of gastric cancer cells

XU Yingxun1,2YANG Cheng1

1 Department of Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University, Yantai 264003, P.R.China;2 Department of General Surgery, Branch Hospital of Heze Municipal Hospitial

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miR-100 on the invasion,migration andradiosensitivity of NCI-N87 cells.MethodsThe mature type human miR-100 was synthesized chemically.The synthesized miR-100 was transfected into NCI-N87 cells via Lipofectamine-2000. The expression of miR-100 was detected by real-time PCR.MTT assay was used to investigate the function of miR-100 on the proliferation of NCI-N87 cells. Colony-forming assay was used to study the effect of miR-100 on the radio sensitivity of NCI-N87 cells.Flow cytometry was conducted for the detection of cell apoptosis.The invasion of NCI-N87 cells was investigated with Transwell Chamber assay.The metastasis of NCI-N87 cells was detected with cell scratch assay.The expression levels of MMPs were detected with Western blot.ResultsIn order to confirm the biological effects of miR-100 during the development of gastric carcinoma, we synthesized human miR-100 mimic and miR-100 inhibitor, which was transfected into gastric cancer cell lines.Increased miR-100 expression suppressed cell growth,while overexpression of miR100 significantly promoted apoptosis by flow cytometry. Colony-forming assay showed that miR-100 could greatly enhance the radiosensitivity of NCI-N87 cells.Through wound healing test and Transwell migration assay,we observed that transfection of human miR-100 mimic,reduced the migration ability compared with the control group.On the contrary,the function was oppositive treated with miR-100 inhibitor. The expression of MMP-2 and MMP-9 were inhibited showed by Western blot.ConclusionsMiR-100 can inhibit the ability of migration, invasion and proliferation and promote the apoptosis and radiosensitivity of NCI-N87 cells.

【Keywords】miR-100, NCI-N87,radiosensitivity,invasion,migration

(收稿日期：2015-10-26)

【中圖分類號】R34

【文獻標志碼】A

【文章編號】1001-9510(2016)02-0096-04

通訊作者：楊成，E-mail: yangchxn@163.com1材料和方法