幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)和鑒定*

劉正美， 周建獎， 趙　艷， 熊　林， 龍妮婭， 謝　淵*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽　550004)

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幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)和鑒定*

劉正美**， 周建獎， 趙艷， 熊林， 龍妮婭， 謝淵***

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 建立一種幽門螺桿菌(H.pylori)臨床菌株的分離培養(yǎng)的方法。方法: 取臨床胃黏膜組織標(biāo)本88株，接種于10%綿羊全血的哥倫比亞選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃、 5% O2 、10% CO2 、85% N2培養(yǎng)3～5 d后，挑取血平板上透明細(xì)小可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色和尿素酶試驗(yàn),對陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大純培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增H.pylori 16sRNA、CagA基因，電泳并進(jìn)行測序鑒定。結(jié)果: 成功從臨床胃黏膜組織中分離培養(yǎng)出H.pylori，88例胃黏膜組織標(biāo)本中分離培養(yǎng)并鑒定出H. pylori 19株，陽性率為22%；對16sRNA及CagA基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳可見目的條帶，并對16sRNA擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)菌株26695比對，同源性為95%～99%。結(jié)論： 37 ℃、 5% O2 、10% CO2 、85% N2條件下10%綿羊全血的哥倫比亞選擇性培養(yǎng)基上能成功分離培養(yǎng)出H.pylori臨床株。

[關(guān)鍵詞]幽門螺桿菌; 分離培養(yǎng); 臨床菌株； 革蘭染色； CagA基因

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一種呈螺旋狀或S形、微需氧的革蘭氏陰性桿菌，由澳大利亞科學(xué)家Mashall和Warren于1983年從慢性胃炎病人的胃黏膜中首次分離并成功培養(yǎng)[1-2]。H.pylori是全球最常見的感染性病原菌之一，是慢性胃炎、胃潰瘍的主要致病因素[3-4]，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。近年來的許多研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染與心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、皮膚疾病以及口腔疾病等的發(fā)生密切相關(guān)[6-8]。目前流行病學(xué)研究顯示，發(fā)達(dá)國家H.pylori的感染率為30%～50%，中國作為人口眾多的發(fā)展中國家，是H.pylori的高感染區(qū)，H.pylori感染率高達(dá)40%～90%，平均為59%[9]。H.pylori臨床菌株的分離培養(yǎng)是診斷H.pylori感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”[10-11]，亦是H.pylori基礎(chǔ)及臨床研究的一項(xiàng)基本技術(shù)。成功分離培養(yǎng)的臨床菌株可用于細(xì)菌分型、致病機(jī)制研究、構(gòu)建動物模型及確定致病因子等基礎(chǔ)研究[12]。隨著H.pylori耐藥菌株的日益增加，培養(yǎng)H.pylori還能提供細(xì)菌耐藥性的資料，這對指導(dǎo)臨床用藥極為重要。本文旨建立一種從臨床胃黏膜組織中分離培養(yǎng)出H.pylori培養(yǎng)和鑒定方法。

1材料與方法

1.1材料

在病人知情同意的原則下，從胃鏡中心收取2014-2015年就診患者88例的胃黏膜組織標(biāo)本，其中男42例，女46例，年齡為26～71歲。微需氧培養(yǎng)罐及微需氧產(chǎn)氣袋(850 mL/L N2, 100 mL/L CO2,50 mL/L O2)購自Mitsubishi, Japan。恒溫培養(yǎng)箱，一次性接種環(huán)，哥倫比亞瓊脂(OXOID，英國)，幽門螺桿菌選擇劑(OXOID，英國)，布氏肉湯，革蘭氏染液(安徽巢湖弘慈醫(yī)療公司)，尿素酶試紙(廣東珠海克迪科技公司)，超凈工作臺；脫纖維綿羊全血(友康生物科技有限公司, 北京)。

1.2方法

1.2.1H.pylori運(yùn)送液、凍存液以及哥倫比亞血瓊脂平板的配制H.pylori運(yùn)送液：稱取改良布氏肉湯粉末2.81 g，加熱攪拌溶解于100 mL蒸餾水中,分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌，冷卻后無菌分裝200 μL/管，再于每管內(nèi)加入2.5 μLH.pylori選擇劑，置于4 ℃冰箱。H.pylori凍存液的配制：配制10%蔗糖溶液，高壓滅菌后，與胎牛血清按1∶1比例進(jìn)行配制。哥倫比亞血瓊脂平板：稱取哥倫比亞瓊脂3.9 g，加入雙蒸水90 mL，121 ℃高壓滅菌，冷卻至50 ℃左右時，于超凈工作臺加入10 mL脫纖維綿羊全血，0.4 mLH.pylori選擇劑，混勻后倒入平板。

1.2.2標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)胃鏡下于胃竇部用無菌活檢鉗(用750 mL/L 乙醇火燒滅菌, 冷卻處理)取黏膜組織, 將組織取下置于裝有0.3 mLH.pylori運(yùn)送液的EPP管中, 4 ℃ 2 h內(nèi)送于分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.2.3標(biāo)本接種與培養(yǎng)在超凈工作臺內(nèi)，將組織用高壓滅菌的組織剪剪碎，機(jī)械研磨60 s，將其全部倒入已鋪制好的哥倫比亞血瓊脂平板上，用L型玻璃棒涂抹開，將接種好的血平板置于放有產(chǎn)氣袋的厭氧罐內(nèi)或三氣培養(yǎng)箱(5% O2、10% CO2、85% N2)37 ℃培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4H.pylori鑒定(1)革蘭氏染色，取一環(huán)生理鹽水置于潔凈的載玻片上，挑取血平板上透明細(xì)小可疑菌落于生理鹽水上涂開，待干后，于酒精燈上固定，結(jié)晶紫初染1 min，碘液媒染1 min，酒精脫色30 s，復(fù)紅復(fù)染30 s，顯微鏡下觀察，見革蘭氏染色陰性的細(xì)小、彎曲狀桿菌為H.pylori陽性。(2)尿素酶試驗(yàn)，挑取血平板上透明細(xì)小可疑菌落致尿素酶試紙上，1 min后試紙由黃色變?yōu)榧t色則為H.pylori陽性。(3)H.pylori陽性菌落16sRNA鑒定，對H.pylori陽性菌落進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA,設(shè)計H.pylori16sRNA引物(上游引物5′-CTT GCT AGA GTG CTG ATTA-3′ ，下游引物5′-TCC CAC ACT CTA GAA TAGT -3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，25個循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保溫，目的條帶為550 bp。 PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，若有目的條帶，則將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序，將測序結(jié)果與H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)株26695進(jìn)行序列比對。(4)H.pylori陽性菌落CagA鑒定，對H.pylori陽性菌落進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA，設(shè)計CagA引物(上游引物5′-ACA ATGA CTA ACG AAA CCA-3′，下游引物5′-TTT TGG TAT TCC TTA TCC T-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min, 98 ℃ 60 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 4 min 25個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保溫，目的條帶為3 500 bp。 PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳，若有目的條帶，則將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序。(5)H.pylori菌株的凍存，擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)鑒定的H.pylori菌株，將細(xì)菌用接種環(huán)刮取放置在2 mL凍存管(500 uL凍存液)中,每管置入2～3環(huán)細(xì)菌。迅速放置于-80 ℃冰箱中，過夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長期保存。

2結(jié)果

2.1H.pylori陽性率

本研究從臨床所取88例組織標(biāo)本中分離培養(yǎng)并鑒定出H.pylori陽性菌19株，陽性率為22%。H.pylori在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上微需氧培養(yǎng)3 d后呈灰白色針尖樣菌落(圖1A)，尿素酶試驗(yàn)為陽性(圖1B)；經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察可見革蘭陰性(紫紅色)的細(xì)小、彎曲狀、螺旋狀桿菌(圖1C)；

注：A為H. pylori在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上微需氧培養(yǎng)3 d后呈灰白色針尖樣菌落，B為尿素酶試驗(yàn)陽性，C為H. pylori經(jīng)革蘭染色后在顯微鏡下表現(xiàn)圖1　H.pylori菌落、尿素酶試驗(yàn)及革蘭氏染色Fig.1　H.pylori colony, urease test and the microscopic morphology of gram staining

2.2H.pylori陽性菌落16sRNA鑒定

對H.pylori的16sRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，約在550 bp處可見目的條帶(圖2)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)菌株26695比對，同源性為95%～99%(圖3)。

注：M為 DNA Marker(DL2000)，1為標(biāo)準(zhǔn)菌株26695，2～6為分離培養(yǎng)的H.pylori菌株圖2　H.pylori16sRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2　Electrophoresis map of PCR products of 16sRNA of H.pylori

2.3H.pylori陽性菌落CagA鑒定

對H.pylori的cagA基因進(jìn)行擴(kuò)增，約在3 500 bp處可見目的條帶(圖4)，并對擴(kuò)增產(chǎn)物測序(圖5)。

3討論

H.pylori對營養(yǎng)條件要求較高，一般培養(yǎng)條件很難生長，要求與體內(nèi)胃黏膜下層條件相似，即微需氧(5% O2)環(huán)境，37 ℃，濕度達(dá) 98%以上。目前，H.pylori培養(yǎng)多采用固體培養(yǎng)基，常用的有腦心浸液瓊脂、布氏瓊脂、哥倫比亞瓊脂等。本次H.pylori臨床菌株的分離培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，于病人胃竇部取材后，將組織剪碎涂抹于已配置好的哥倫比亞血瓊脂平板上，前期有36株于厭氧罐內(nèi)，放入產(chǎn)氣袋進(jìn)行培養(yǎng)，后52株培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)的H.pylori生長較好。眾多研究培養(yǎng)H.pylori采用的哥倫比亞固體培養(yǎng)基，其中常加入10%的胎牛血清，本研究加入的是10%的脫纖維綿羊全血，營養(yǎng)更充分，且后期純培養(yǎng)時均采用三氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件較穩(wěn)定，利于H.pylori的生長。

本研究分離培養(yǎng)88株臨床組織標(biāo)本，陽性株有19株，其陽性率為22%。且H.pylori臨床菌株的培養(yǎng)陽性率與入選病人性別、年齡無關(guān)。這與國內(nèi)外報道的H.pylori臨床菌株培養(yǎng)陽性率相比明顯較低。針對H.pylori分離陽性率較低，可能存在以下原因：(1)鉗取患者胃組織標(biāo)本未能及時放入運(yùn)送液，轉(zhuǎn)運(yùn)時間太長；正常情況下將組織分離后轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的時間一般不超過3～4 h，轉(zhuǎn)運(yùn)時間太長或溫度過高會導(dǎo)致細(xì)菌死亡；(2)在接種菌的過程中暴露在空氣中時間過長，導(dǎo)致分離陽性率降低；(3)實(shí)驗(yàn)前期在普通實(shí)驗(yàn)操作臺分離H.pylori，導(dǎo)致雜菌污染而致H.pylori分離失敗，之后在超凈工作臺分離，于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，陽性率略提高；(4)鉗取胃組織的部位也存在H.pylori分布的差異，有文獻(xiàn)報道稱，H.pylori多寄生在胃竇部，但在宿主因素和環(huán)境因素的共同作用下，極有可能向胃底部及賁門部移行，因此鉗取的胃竇部標(biāo)本可能不存在H.pylori感染或數(shù)量極少，不能分離到H.pylori，導(dǎo)致陽性率低[13]。

注:A 為分離培養(yǎng)所得的H.pylori菌株的測序峰圖,B為與國際標(biāo)準(zhǔn)株26695的比對結(jié)果圖3　分離培養(yǎng)所得的H.pylori菌株的測序峰圖及與標(biāo)準(zhǔn)株26695的比對結(jié)果Fig.3　Sequencing map of sample and the blast result compared to international standard 26695 strain

注：M為PNA Marker，1～4為分離培養(yǎng)菌株圖4　H.pylori cagA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4　Electrophoresis map of PCR products of H.pylori CagA gene

H.pylori的最佳培養(yǎng)時限是3 d，此時菌落的肉眼形態(tài)與鏡下菌體形態(tài)均很典型，細(xì)菌處于對數(shù)生長期，可以進(jìn)行傳代、保存或藥物敏感性試驗(yàn)等研究[14]。本次分離培養(yǎng)H.pylori臨床株也證實(shí)了這一點(diǎn)，傳代培養(yǎng)3 d的H.pylori平板上菌落形態(tài)典型，經(jīng)革蘭氏染色后鏡下可見呈S形、螺旋狀，培養(yǎng)約5 d后經(jīng)革蘭氏染色后鏡下可見細(xì)菌開始球形變，呈短桿狀，延長培養(yǎng)至7 d時，此時可能由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分缺失等原因，H.pylori形態(tài)呈球形變，且低溫保存后難以復(fù)蘇成功。所以，本研究把純培養(yǎng)后生長良好H.pylori菌落保存于小牛血清和蔗糖的等體積混合液中，-80 ℃過夜保存后轉(zhuǎn)入液氮長期保存，其復(fù)蘇成功率較高，說明該方法可以很好地用于H.pylori臨床菌株的保存。

圖5　cagA基因部分序列峰Fig.5　The partial sequencing diagram of CagA

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(2016-01-07收稿，2016-03-22修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Isolation and Culture and Identification of Clinical Strains ofHelicobacterpylori

LIU Zhengmei, ZHOU Jianjiang, ZHAO Yan, XIONG Lin, LONG Niya, XIE Yuan

(KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To isolate and culture the clinical strains of Helicobacter pylori (H. pylori) from patients in the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, and to master the methods of isolation, culture and identification of clinical isolates. Methods: 88 samples of specimens were collected from clinical gastric mucosal tissue and inoculated on columbia selective medium with 10% sheep blood, then cultured on the condition of 37 ℃, 5% O2, 10% CO2, 85% N2 for 3～5 days. The transparent small suspicious colonies on blood agar were picked out to undergo Gram staining and rapid urease test. The positive colonies were expanded by pure culture. DNA of bacterial was extracted and 16sRNA of H. Pylori was amplified by PCR. Electrophoresis and sequencing were conducted for identification. Results: 19 strains of H. Pylori from 88 samples of specimens collected from clinical gastric mucosal tissue were successfully isolated, cultured and identified. The positive rate was 22%. 16sRNAand CagA of H. Pylori were amplified by PCR and their electrophoresis strips were clearly visible. The sequenced 16sRNA amplification products were compared with H.pylori international standard strain 26695, and their homology was 95%～99%. Conclusion: H.pylori clinical strains are successfully isolated and cultured, and the method of isolation, culture and identification of H.pylori clinical isolates was skillfully mastered.

[Key words]Helicobacter pylori; isolation and culture; clinical strains； Gram stain； CagA gene

[中圖分類號]R378.99

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)04-0402-05

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(No.81260303)

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:xieyuan1974@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1808.020.html