利用SSR標記鑒定西瓜雜交種純度的研究

劉子記 詹園鳳 朱婕 賀滉

摘 要 建立快速、準確、穩(wěn)定的種子純度檢測技術是保證西瓜雜交種質量的有效措施。利用分子標記技術對小型西瓜‘美月雜交種純度進行鑒定。從均勻分布于不同西瓜染色體上的88對SSR引物中篩選出8對引物在‘美月親本間表現(xiàn)明顯的多態(tài)性，分別位于第1、2、3、6、8、9、10染色體上，多態(tài)性比率為9.09%，多態(tài)性標記均為共顯性標記。為了提高檢測效率，結合多態(tài)性片段大小，同時對標記SSR48和SSR62進行擴增，可成功獲得221 bp和131 bp的兩組特異性條帶，成功建立了雙重PCR體系。為了提高鑒定結果的準確性，選用位于西瓜不同染色體上的4對共顯性標記對‘美月進行純度檢測，4對標記的檢測結果高度一致，‘美月雜交種純度為99.44%。標記鑒定結果與田間表型鑒定結果比較分析表明，2種鑒定結果高度一致。研究結果可為西瓜雜交品種純度快速檢測和品種權保護提供理論依據與技術支撐。

關鍵詞 小型西瓜；雜交種；雙重PCR技術；純度鑒定

中圖分類號 S651 文獻標識碼 A

＼ 西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. & Nakai]為葫蘆科（Cucurbitaceae）西瓜屬（Citrullus）一年生蔓性草本植物[1]，原產非洲南部[2]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[3]，包括3個亞種：C. lanatus subsp. lanatus L.，古老的栽培種群組，生長于南非；C. lanatus subsp. mucosospermus L.，籽用型西瓜群組；C. lanatus subsp. vulgaris L.，果肉具有甜味的西瓜群組，現(xiàn)代栽培的優(yōu)良西瓜品種由此亞種衍生而來[4]。西瓜在中國已有上千年的栽培歷史，中國是西瓜最大的生產國和消費國，平均年產量6 800萬t[5]。其果實脆嫩，味甜多汁，營養(yǎng)豐富，富含多種礦物質和維生素。隨著人民生活水平的提高，飲食習慣的變化，種植結構的調整，西瓜栽培面積逐漸擴大，已成為增加農民收人和促進農村經濟發(fā)展的重要作物之一。選育適應不同地區(qū)和栽培模式的西瓜新品種是當今西瓜育種的主要任務。小型西瓜外形美觀，單瓜重為1.0～2.5 kg，含糖量可達13%～14%，肉質多汁脆甜，生育期短。因其品質優(yōu)良、早熟，市場價格較高，經濟效益遠遠高于普通西瓜，種植面積呈現(xiàn)穩(wěn)定增長的趨勢。

中國西瓜生產用種已100%實現(xiàn)雜種化。種子是重要的農業(yè)生產資料，種子質量優(yōu)劣直接影響農產品質量和優(yōu)良品種的增產潛力，開展種子純度檢測對保證種子質量和提高生產效益具有重要意義。雜交種純度檢驗的常用方法包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術鑒定等[6]。種子形態(tài)鑒定準確性較差；田間鑒定周期較長，表型易受栽培措施和環(huán)境條件影響；同工酶鑒定多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性[7]。西瓜遺傳基礎狹窄，傳統(tǒng)的鑒定方法難以滿足雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來，隨著測序技術的迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測雜交種純度成為可能。分子標記技術能夠從DNA水平上檢測子代與親本間的微小差異，不受時空限制，可以大大縮短檢驗時間[8]。歐陽新星等[9]利用RAPD標記對‘無籽京欣一號西瓜種子純度進行鑒定，多態(tài)性引物可有效區(qū)分母本與雜交種。劉澤發(fā)等[10]采用SRAP標記開展了西瓜品種紅小玉雜交種純度鑒定，分子鑒定結果與大田鑒定結果高度吻合。周賢達等[11]以西瓜雜交一代品種黑寶、紅與黑、黑優(yōu)美及其親本為試驗材料，利用EST-SSR標記對西瓜雜交種純度進行了快速鑒定，鑒定結果與田間鑒定結果一致。由于RAPD標記重復性和穩(wěn)定性較差，SRAP標記多為顯性標記，EST-SSR標記多態(tài)性較低，利用RAPD、SRAP、EST-SSR標記進行純度鑒定具有一定的局限性。在真核生物基因組中SSR標記具有數量豐富、分布均勻、共顯性遺傳、操作簡單等優(yōu)點，是進行遺傳多樣性分析、雜交種純度鑒定及分子輔助育種的理想標記類型[12]。SSR標記在小型西瓜雜交種純度鑒定方面的研究鮮有報道。本研究以小型西瓜品種‘美月為研究對象，旨在利用SSR標記建立小型西瓜雜交種純度鑒定技術，以期為小型西瓜育種、制種、良種的及時銷售及品種保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為小型西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. & Nakai]雜交種一代‘美月、母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1。‘美月為中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所選育的早熟小型西瓜雜交品種，全生育期冬播75～80 d，夏播63～65 d，果實平均發(fā)育期為28 d，植株生長勢較強，第一雌花節(jié)位6～8節(jié)，雌花間隔4～5節(jié)。果實短橢圓形，果型指數為1.29，外觀清秀，深綠果皮覆墨綠細齒條帶14～15條，果肉鮮紅色，色澤均勻，中心含糖量為12.5%～13%，最高可達14%，邊緣含糖量為9%～10%，肉質細膩無纖維，口感極佳，果皮薄，皮厚0.4～0.5 cm，抗病性強，適于保護地栽培。將供試材料播種于營養(yǎng)缽中，待植株長至2片真葉時取材備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 待植株長至2片真葉時，摘取1片真葉，利用Sharp等[13]的CTAB法提取MH-35-1、MH-9-1和‘美月單株的基因組DNA。

1.2.2 多態(tài)性標記分析 參考已開發(fā)的西瓜SSR標記和構建的遺傳連鎖圖譜[14]，選擇了均勻分布于西瓜11條染色體上的88對SSR標記，其中11對位于1號染色體，9對位于2號染色體，7對位于3號染色體，8對位于4號染色體，9對位于5號染色體，7對位于6號染色體，7對位于7號染色體，5對位于8號染色體，8對位于9號染色體，8對位于10號染色體，9對位于11號染色體。以母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1基因組DNA為模板進行擴增，篩選在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標記。

PCR反應體系為10 μL，其中包括9 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），55 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgCl2，

0.20 mmol/L dNTPs，55 ng引物，0.80 U Taq DNA聚合酶，75 ng模板DNA。擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR產物保存于10 ℃。4 μL擴增產物與2 μL上樣緩沖液混合經12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=29 ∶ 1）于200 V電泳4 h，銀染顯色進行帶型統(tǒng)計。

1.2.3 雙重PCR技術建立 參考多態(tài)性標記目的片段大小及引物之間的互補性，進行引物組合，以母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1基因組DNA為模板進行擴增，結合單引物擴增結果，將多態(tài)性片段進行分組，建立雙重PCR擴增技術。

1.2.4 分子標記種子純度鑒定 以‘美月小型西瓜單株DNA為模板，利用在親本材料間表現(xiàn)為共顯性的SSR標記進行擴增，根據特異譜帶的有無檢測雜交種的純度。品種純度=（1-a/A）×100%，其中A為待測‘美月種子數目，a為單獨具有母本譜帶特征或單獨具有父本譜帶特征或既不同于‘美月譜帶特征也不同于父母本譜帶特征的植株數目。

1.2.5 田間純度鑒定 將取材后的西瓜幼苗按照原順序移栽到地勢平坦、土質肥沃的試驗基地，試驗地的管理參照小型西瓜栽培措施，在果實成熟期依據品種的特征特性逐株進行鑒定，將標記鑒定結果與田間鑒定結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性標記篩選

以‘美月母本材料MH-35-1和父本材料MH-9-1為模板篩選88對均衡分布于西瓜11條染色上的SSR引物，其中8對引物在親本間能擴增出明顯的多態(tài)性，多態(tài)性比率為9.09%，多態(tài)性標記均為共顯性標記，擴增出互補的特異譜帶能將雜交種與親本材料區(qū)分開來，多態(tài)性片段大小127～228 bp，分別位于西瓜第1、2、3、6、8、9、10染色體上（表1、圖1）。

2.2 雙重PCR技術建立

結合多態(tài)性引物擴增模式及多態(tài)性片段大小，將多態(tài)性標記進行組合。SSR48多態(tài)性片段大小為221 bp，SSR62多態(tài)性片段大小為131 bp，比較兩對標記多態(tài)性片段對應區(qū)域發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性片段區(qū)域雜帶較少。分別以母本材料MH-35-1、父本材料MH-9-1和‘美月單株基因組DNA為模板，同時對引物SSR48和SSR62進行擴增，多態(tài)性片段分布在兩個區(qū)域，第1個區(qū)段為引物SSR48多態(tài)性片段分布區(qū)域，第2個區(qū)段為引物SSR62多態(tài)性片段分布區(qū)域。從擴增結果發(fā)現(xiàn)，19號單株僅具有母本特異譜帶，不具有父本特異譜帶，為母本自交株（圖2）。其余單株均同時具有母本特異譜帶和父本特異譜帶，為真實雜交種。兩對標記的檢測結果一致。

2.3 結合多對標記鑒定雜交種純度

為了確保檢測結果的準確性，采用另外2對位于西瓜不同染色體上的共顯性標記SSR21和SSR71對180株‘美月小型西瓜進行純度鑒定，從標記擴增結果發(fā)現(xiàn)，179個單株既具有母本特異譜帶也具有父本特異譜帶，屬于真實的雜交種，19號單株缺少父本特異帶，與母本擴增譜帶一致，說明19號單株為母本自交株，與標記SSR48和SSR62檢測結果一致（圖3），‘美月小型西瓜品種的純度為99.44%。

2.4 田間種子純度鑒定

果實成熟期田間調查結果發(fā)現(xiàn)，母本MH-35-1植株生長勢中等，主蔓第6～7節(jié)出現(xiàn)第1雌花，果實外形美觀，果實圓球形，瓤肉鮮紅色，皮厚0.45 cm左右，較韌。父本MH-9-1果實長橢圓形，花皮覆墨綠寬鋸齒條帶，瓤肉紅色，皮厚0.5 cm左右，較脆，植株長勢強。‘美月植株生長勢強，果實整齊、外觀漂亮，短橢圓形，深綠果皮覆墨綠細齒條帶，瓤肉紅色，果肉組織細膩，無纖維，口感極佳，抗病能力強，皮厚0.4～0.5 cm，較脆。19號植株與母本性狀一樣，易座果，果實圓形，皮較韌，植株長勢較強。其余植株均具有‘美月小型西瓜品種的典型特征，生長一致，果實外觀漂亮，短橢圓形，深綠果皮覆墨綠細齒條帶，果皮較脆。田間形態(tài)學鑒定結果與分子標記鑒定結果高度一致，試驗結果說明利用SSR標記進行小型西瓜雜交種純度鑒定是可行的。

3 討論與結論

3.1 分子標記技術的發(fā)展為高效、準確檢測西瓜品種純度提供技術支撐

我國西瓜的栽培面積及產量均居世界首位，自20世紀80年代以來，西瓜雜交品種在我國迅速普及推廣，栽培面積逐年擴大，在人工制種過程中，常因生物混雜、母本自交和機械混雜導致種子不純，給生產造成嚴重損失[15]。雜交種純度檢驗的常用方法主要包括形態(tài)鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術鑒定等。種子形態(tài)鑒定很難將母本相同父本不同的西瓜品種區(qū)別開[16]。西瓜田間純度鑒定周期長，占地多，費用高[17]。黃永紅等[18]利用過氧化物同工酶對6個西瓜雜交組合進行了純度鑒定研究，但同工酶具有組織和器官特異性，難以發(fā)掘統(tǒng)一的特征譜帶來檢測不同西瓜雜交種的純度[19]。分子標記技術的發(fā)展能夠從基因組水平檢測微小遺傳差異，能夠將遺傳差異較小的品種區(qū)分開來，為雜交種純度精確鑒定帶來契機。AFLP、RAPD、SRAP標記相繼應用于西瓜品種純度鑒定[9-10，20]，但這幾種標記在應用的過程中存在一定的局限性，如操作復雜、顯性遺傳、穩(wěn)定性較差等。與前幾種標記相比，采用SSR標記進行小型西瓜雜交種純度鑒定具有無可比擬的優(yōu)越性。本試驗采用SSR分子標記技術鑒定小型西瓜‘美月品種純度，能夠準確地將母本自交種與雜交種區(qū)分開來，與田間純度鑒定結果高度一致。

3.2 雙重PCR技術構建可以顯著提高檢測效率

雙重PCR技術與單一PCR相比，具有快速、準確、靈敏和可靠的優(yōu)點。韓廣濤等[21]建立了雙重PCR技術，能夠同時對馬鈴薯環(huán)腐病和黑脛病進行檢測，大大節(jié)省了檢測時間和費用。截止目前，采用雙重PCR技術檢測西瓜品種純度的研究鮮有報道，本研究利用在‘美月親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物，在充分考慮多態(tài)性片段大小和多態(tài)性區(qū)域雜帶存在與否的情況下進行組合，成功建立雙重PCR技術，單次PCR過程可同時采用2對SSR標記對小型西瓜雜交種進行純度鑒定，不僅能夠節(jié)約檢測時間，而且能夠提高檢測的準確性。該技術的建立能夠對幼苗期的西瓜植株進行快速而準確的檢測，對保證小型西瓜品種‘美月雜交種純度和良種的及時銷售具有重要意義。

3.3 多引物結合可以顯著提高檢測結果的準確性

采用單一引物進行雜交種純度檢測雖然可以有效區(qū)分混入雜交種中的親本自交種，但對于混雜其中的其他品種很難區(qū)分開來，然而選取多對位于不同染色體上的標記進行檢測，恰恰可以實現(xiàn)這一目的[22]。為確保鑒定結果的準確性和可靠性，進一步排除生物混雜和機械混雜，本研究選取4對位于西瓜不同染色體上的共顯性SSR標記檢測‘美月雜交種純度，4對標記的檢測結果完全一致，‘美月雜交種中僅混雜了母本自交種，這可能是由于同株雄花花粉被昆蟲傳到雌蕊柱頭所致。分子標記鑒定結果與田間形態(tài)鑒定結果完全一致，該研究結果表明利用SSR分子標記技術檢測‘美月雜交種純度是切實可行的。

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