盧占軍 趙培婭 劉映雪 丁鵬 蘇華楠 易龍 鐘八蓮

摘要：【目的】研究亞洲韌皮桿菌（CLas）在紐荷爾臍橙病樹的分布情況，為柑橘黃龍病（HLB）的防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?～3個(gè)枝條表現(xiàn)斑駁黃化葉片癥狀的紐荷爾臍橙病樹為研究對象，對主干發(fā)出的5個(gè)主枝（A、B、C為斑駁黃化枝條，D、E為無癥狀枝條）的葉片分別取樣，運(yùn)用PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分別檢測，用2-ΔΔCt法分析樹體各部分黃龍病菌含量。對于果樹上表現(xiàn)典型HLB病果但葉片無癥狀的結(jié)果枝，分別檢測典型病果和相應(yīng)葉片的感病情況?！窘Y(jié)果】PCR對A、B、C、D、E的陽性檢出率分別為88.57%、61.11%、54.17%、6.67%和0，qPCR對A、B、C的陽性檢出率均為100.00%，對D、E的陽性檢出率分別為40.00%和13.33%；2-ΔΔCt法分析發(fā)現(xiàn)，斑駁黃化葉片中病原菌含量更高，病果的陽性檢出率高于相應(yīng)的無癥狀葉片樣品?！窘Y(jié)論】CLas在表現(xiàn)典型斑駁黃化癥狀的葉片和果實(shí)中的含量及陽性檢出率均較高，病原菌在病樹中分布不均勻。在進(jìn)行HLB檢測時(shí)，應(yīng)選取典型或疑似癥狀樣品，并運(yùn)用qPCR進(jìn)行檢測，一旦發(fā)現(xiàn)樹體局部發(fā)病，應(yīng)當(dāng)整株銷毀。

關(guān)鍵詞： 柑橘黃龍病；亞洲韌皮桿菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；2-ΔΔCt法

中圖分類號(hào)： S432.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）09-1512-05

Abstract：【Objective】Distribution of Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas） in Newhall navel orange tree was investigeted， in order to provide reference for prevention and control of citrus Huanglongbing（HLB）. 【Method】Newhall tree were used as research object， which had 1-3 branches with mottled yellow leaf symptoms. The leaves were collected from five main branches（A， B and C branches with mottled yellow leaves， D and E asymptomatic branches） on the trunk， respectively. Then samples were detected and analysed by using PCR and quantitative real-time PCR（qPCR）， and CLas content in different parts of tree was analyzed by using 2-ΔΔCt method. For some branches with pathognomonic HLB-infected fruits but without symptomatic leaves， their fruits and leaves were detected， respectively. 【Result】The results showed that， using PCR method， the positive rates of A， B， C， D， E were 88.57%， 61.11%， 54.17%， 6.67% and 0， respectively， while using qPCR method， the positive rates of A， B， C， D， E were 100.00%， 100.00%， 100.00%， 40.00%， 13.33%， respectively. Furthermore， 2-ΔΔCt analysis showed that， CLas content was higher in mottled yellow leaves than asymptomatic leaves， and the positive rate of infected fruits was higher than corresponding asymptomatic leaves. 【Conclusion】Content and positive rate of CLas are higher in mottle yellow leaves and pathognomonic HLB-infected fruits than asymptomatic leaves， and CLas was distributed unevenly in the whole infected tree. In the detection， the samples with typical symptoms or suspected samples should be selected， and then detected by qPCR method. Furthermore， once partial branchs of tree are found to be infected， the whole tree should be destroyed immediately.

Key words： citrus Huanglongbing； Candidatus Liberibacter asiaticus； quantitative real-time PCR； 2-ΔΔCt method

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是近年來柑橘生產(chǎn)中最具毀滅性的病害，其流行范圍廣，無有效化學(xué)藥劑可治療，是世界柑橘產(chǎn)業(yè)面臨的主要難題（Bové， 2014；Wang and Trivedi，2013）。目前應(yīng)對HLB威脅的方法以防控為主，因此，了解柑橘黃龍病病原菌在寄主中的運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散、分布等情況，對于開展柑橘黃龍病早期檢測和疫情監(jiān)控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Garnier等（1984）首次通過電鏡觀察到HLB病原菌是寄生于植物篩管的細(xì)菌，由于無法人工培養(yǎng)，尚未完成柯赫氏法則驗(yàn)證。該病原菌被暫定為韌皮桿菌屬下3個(gè)種：亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus， CLas）、非洲種（Ca. L. africanus， CLaf）和美洲種（Ca. L. americanus， CLam）（Jagoueix et al.， 1994；Texeira et al.， 2005），其中以CLas分布最廣、危害最嚴(yán)重，我國目前主要為CLas（蘇華楠，2013）。Tatineni等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，HLB病原菌在病樹體內(nèi)分布不均勻；Teixeira等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，美洲種在同一樹體內(nèi)斑駁黃化葉片的陽性檢出率和含量最高，一般常規(guī)PCR即可檢出，含量為107拷貝/g，其余依次為缺鋅癥狀葉片、無癥狀葉片；Li等（2009）的研究結(jié)果表明，同一樹體的不同組織CLas含量差異較明顯，其中果實(shí)隔膜和中柱的病原菌含量最高。【本研究切入點(diǎn)】HLB病原菌早期檢測最常用的是PCR技術(shù)，包括PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），其中qPCR實(shí)時(shí)收集熒光信號(hào)，耗時(shí)短，靈敏度比常規(guī)PCR高兩個(gè)數(shù)量級(jí)（Tatineni et al.，2008）。目前，運(yùn)用qPCR相對定量法（2-ΔΔCt）研究柑橘黃龍病菌在病樹中含量差異的研究鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以田間1～3個(gè)枝條表現(xiàn)葉片斑駁黃化的整株紐荷爾臍橙病樹為主要研究對象，分別運(yùn)用PCR和qPCR進(jìn)行檢測，分析亞洲韌皮桿菌（CLas）在病樹中的含量分布；結(jié)合贛州章貢區(qū)一失管果園大量果樹表現(xiàn)的同一枝條上出現(xiàn)無癥狀葉片和有癥狀果實(shí)的現(xiàn)象，采用常規(guī)PCR分別檢測典型病果和相應(yīng)葉片，以掌握CLas在病樹、病果及相應(yīng)無癥狀葉片中的分布情況，探索更佳的取樣和檢測方法，為柑橘黃龍病早期檢測和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年11月在國家臍橙工程技術(shù)研究中心進(jìn)行，陰、陽性對照均取自國家臍橙工程技術(shù)研究中心玻璃溫室。

感病臍橙葉片樣品采集：樣品取自贛州市章貢區(qū)儀豐果園，樹齡4年。田間選取初期觀察到僅1～3個(gè)枝條出現(xiàn)典型斑駁黃化葉片的紐荷爾臍橙果樹，病樹主干發(fā)出5個(gè)主枝分別編號(hào)A、B、C、D、E（圖1），取同一分支的葉片為1個(gè)樣品，其中A（44份樣品）、B（26份樣品）、C（24份條樣品）為斑駁黃化葉片主枝，D（30份樣品）、E（30份樣品）為無癥狀葉片主枝，共取樣154份。

HLB病果和無癥狀葉片樣品采集：田間選取贛州章貢區(qū)某失管果園不同果樹表現(xiàn)典型HLB病果但葉片無癥狀的結(jié)果枝，每枝條取5～6個(gè)葉片作為1個(gè)樣品，共取樣96份，同時(shí)采集相應(yīng)結(jié)果枝的病果96份（圖2）。

1. 2 PCR及qPCR檢測

樣品總DNA提取采用改良CTAB-Triton法（蘇華楠等，2014）。

PCR檢測引物為Las606/LSS，序列見表1。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，10×Buffer緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL ，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL rTaq DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O，19.7 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

qPCR檢測引物和內(nèi)參引物分別為f-rplLAs/r-rplLAs和UPL7-F/UPL7-R，序列見表1，檢測基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本一致。每個(gè)樣品重復(fù)3次，每次反應(yīng)均設(shè)置內(nèi)對照和無模板混合液對照，以國家臍橙工程技術(shù)研究中心玻璃溫室保存的陽性樣品為內(nèi)對照。qPCR反應(yīng)體系15.0 μL：iTaqTM Universal SYBR Premix（2×conc.）7.5 μL，ddH2O 5.3 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.6 μL，模板1.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，64 ℃ 30 s，采集熒光信號(hào)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 10 s，67 ℃ 5 s，每加0.5 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。反應(yīng)在ABI Step-One儀器上運(yùn)行。

1. 3 CLas相對定量分析

qPCR數(shù)據(jù)運(yùn)用2-ΔΔCt法分析。3個(gè)重復(fù)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)即Ct差距在1以內(nèi)的取平均值；若3個(gè)重復(fù)均無擴(kuò)增或兩次未擴(kuò)增，一次Ct>35，均視為陰性；否則重新進(jìn)行試驗(yàn)。以CLas含量最低的樣品為參照，用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，參照Livak和Schmittgen（2001）對qPCR分析基因表達(dá)的相對定量采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析，為使結(jié)果更直觀取lg2 （-ΔΔCt）為縱坐標(biāo)表示各檢測樣品的相對含菌量制圖，即縱坐標(biāo)軸的數(shù)值n相當(dāng)于病原菌CLas相對含量為10n，并用Adobe Illustrator CC繪制各枝條葉片病菌分布圖。

1. 4 病果與無癥狀葉片CLas檢測

運(yùn)用PCR對96份病果和相應(yīng)的96份無癥狀葉片進(jìn)行檢測，引物為Las606/LSS，反應(yīng)程序和體系同1.2。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR和qPCR對病樹樣品的檢測效果比較

PCR對A、B、C 3個(gè)斑駁黃化枝條陽性檢出率分別為88.57%、61.11%和54.17%，而qPCR對A、B、C 3個(gè)枝條的陽性檢出率均為100.00%；PCR對D、E 2個(gè)枝條的陽性檢出率分別為6.67%和0，而qPCR對二者的陽性檢出率分別為40.00%和13.33%。此外，qPCR檢測結(jié)果覆蓋了PCR的檢測結(jié)果，如樣品C1～C21，PCR檢測結(jié)果僅C1、C2、C7、C13、C17～C21呈陽性（圖3），而qPCR檢測結(jié)果為C1～C21均呈陽性（圖5），說明qPCR較PCR更靈敏。

2. 2 感病樹體CLas相對含量分析

由圖4可知，A、B和C枝條所有樣品中均能檢測到CLas存在，A枝條葉片整體相對含菌量高于B和C枝條， D、E枝條只有部分葉片檢出有CLas存在，其中E枝條30個(gè)樣品中僅有4個(gè)檢測到CLas，各枝條的CLas最高含菌量與最低含菌量相差104～1010倍。說明CLas主要分布在下部有斑駁黃化枝條樣品中，在上部無癥狀枝條樣品中分布較少。

對照圖4和圖5中各枝條的采樣點(diǎn)整體上分析，發(fā)現(xiàn)主枝A、B近主干端的樣品CLas相對含量更高，樹冠外圍含量稍低，主枝C中C17～C24所在側(cè)枝的整體CLas相對含量高于該主枝的其他樣品，主枝D、E也有部分樣品檢測到CLas，說明CLas普遍存在于感病樹體內(nèi)。

2. 3 病果及無癥狀葉片感病情況

經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HLB病果陽性檢出率為100.00%，無癥狀葉片陽性檢出率為60.40%。HLB病果陽性率高于無癥狀葉片，且看似無癥狀的葉片，實(shí)則已感染HLB。

3 討論

（1）斑駁黃化樣品病原菌含量比無癥狀樣品高。斑駁黃化枝條A、B、C病原菌相對含量比無癥狀枝條D、E相對含量高，同一結(jié)果枝上的病果比無癥狀葉片陽性檢出率約高40.00%。由此可見，表現(xiàn)典型癥狀樣品的病原菌相對含量和陽性檢出率均高于無癥狀樣品，與Teixeira等（2008）的研究結(jié)果一致。本研究將整株樹分為5個(gè)部分，A、B、C為近地面枝條，D、E為遠(yuǎn)地面枝條，前者斑駁黃化癥狀明顯，后者無癥狀，熒光定量檢測表明前者樣品全部感病，后者樣品部分感病，前者的整體病原菌相對含量高于后者。

（2）病原菌分布不均勻。病樹樣品病原菌相對含量相差達(dá)104～1010倍，與Li等（2009）的研究結(jié)果相似。Li等（2009）發(fā)現(xiàn)田間自然感染CLas的果樹地上部分和根部組織病原菌相對含量可達(dá)1010個(gè)/g，同一樹體的不同組織含量差異較明顯。本研究中，D、E枝條有少部分樣品感病，其中D22和E21的病原菌相對含量甚至高于A、B、C中的大部分樣品，說明CLas在病樹體內(nèi)分布不均勻，與Tatineni等（2008）的研究結(jié)果一致。分析A、B、C的病原菌相對含量發(fā)現(xiàn)，近主干端比遠(yuǎn)主干端含量更高，推測這些枝條的病原菌可能由根部移動(dòng)而來。Johnson等（2014）發(fā)現(xiàn)樹體經(jīng)帶菌木虱刺吸取食后會(huì)在根部有相對較高的病原菌含量，在HLB癥狀嚴(yán)重的病樹上發(fā)現(xiàn)根部組織已大部分死亡，因此推測CLas由根部傳向其他部位。但Ding等（2015）用DTBIA方法研究了CLas在柑橘和長春花中的含量，結(jié)果表明葉柄含菌量最高、根部最低，與陳傳武等（2015）的研究結(jié)果一致。因此，CLas在同一樹體不同組織或不同部位含量差異很明顯，且分布不均勻，而關(guān)于根部病原菌含量高低及傳播機(jī)制等問題尚有待進(jìn)一步探索。

（3）對未顯癥葉片原因的探討。2014年臍橙采摘期，在贛南地區(qū)的果園發(fā)現(xiàn)一些果樹葉片無HLB癥狀，但果實(shí)表現(xiàn)典型癥狀現(xiàn)象。對兼有HLB病果和無癥狀葉片的結(jié)果枝的研究發(fā)現(xiàn)，無癥狀葉片有高達(dá)60.40%的陽性檢出率，無癥狀葉片陽性葉片可能早期已經(jīng)感病，但處于潛伏期，直到果實(shí)成熟后才在果實(shí)表現(xiàn)癥狀。Faghihi等（2009）和García-Pérez等（2013）的研究結(jié)果表明，HLB在田間感染大樹后，潛伏期可能長達(dá)5年以上，通過柑橘木虱傳播的CLas潛伏期階段存在很大不確定性。因此，葉片是否表現(xiàn)癥狀與潛伏期長短有關(guān)，但CLas普遍存在于染病樹體內(nèi)。在柑橘生產(chǎn)中，對于病樹不能只砍病枝，應(yīng)完全砍除病株銷毀，以絕后患。

（4）病原菌含量隨季節(jié)而變化。有關(guān)CLas含量隨季節(jié)變化的研究也有報(bào)道，不同月份病樹體內(nèi)CLas含量變化較大，一年中CLas含量最高的季節(jié)是秋季，此時(shí)Ct最低，斑駁癥狀最明顯（Sauer et al.， 2015）。胡浩（2007）的研究結(jié)果表明，CLas在病樹體內(nèi)10月含量最高，之后隨時(shí)間的推移而降低，推測冬季低溫對CLas的繁殖和木虱的傳播有明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，HLB侵染臍橙果樹后病原菌普遍存在于病樹體內(nèi)，但分布不均勻，在有癥狀的樣品中病原菌相對含量整體上比無癥狀的樣品高。在早期檢測時(shí)，應(yīng)選取典型或疑似癥狀樣品采用qPCR進(jìn)行檢測，若檢測結(jié)果為感染HLB，則應(yīng)將病株整株銷毀。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）