月季‘卡羅拉’的組培快繁技術(shù)

閆海霞 蔣月喜 黃昌艷 鄧杰玲 何荊洲新 王曉國(guó)

摘 要 以‘卡羅拉月季為試材，研究了不同基本培養(yǎng)基、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度對(duì)月季組培快繁影響，以期建立月季‘卡羅拉組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明：適宜月季‘卡羅拉莖段表面滅菌的最佳組合是75%酒精滅菌30 s結(jié)合0.1%升汞處理10 min，污染率為0，芽誘導(dǎo)率為100.00%。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，以WPM為基本培養(yǎng)基有利于各階段的培養(yǎng)，最適宜增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是WPM+3.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，增殖系數(shù)為4.48，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，植株健壯；最適宜的生根培養(yǎng)基為WPM+0.30 mg/L IBA，生根率96.00%，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，主根平均長(zhǎng)度3～4 cm。

關(guān)鍵詞 月季；卡羅拉；組培；木本培養(yǎng)基

中圖分類號(hào) S685.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

The Tissue Culture and Rapid

Regeneration of Rosa hybrida‘Carola

YAN Haixia， JIANG Yuexi， HUANG Changyan，

DENG Jieling， HE Jingzhou， WANG Xiaoguo， BU Zhaoyang*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract The tissue culture technique system of Rosa hybrida‘Carola under different media， different concentration of plant hormone combinations was studied.The results showed that the best sterilization method was 0.1% HgCl2 with 10 minutes and 75% alcohol with 30 second， the contamination was 0 and survival rate was 100.00%. In the process of tissue culture， the woody plant medium as the basic medium is conducive to the cultivation of each stage， the most suitable culture medium for multiplication was WPM+3.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA， the multiplication coefficient was 4.48. The optimum culture medium for rooting culture was 1/2MS+NAA0.20 mg/L， and the rooting rate was 96.00%.

Key words Rosa hybrida；Carola；Ttissue culture； Woody plant medium

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.014

月季屬薔薇科薔薇屬多年生落葉或常綠灌木，原產(chǎn)我國(guó)，現(xiàn)世界各地廣泛栽培。月季品種約有3萬(wàn)多個(gè)，‘卡羅拉是目前市場(chǎng)上銷量最大的切花月季品種之一，其花色純正、花莖直挺、花期長(zhǎng)，抗病性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，產(chǎn)量穩(wěn)定，在眾多切花月季品種中，品質(zhì)極其出眾。多數(shù)月季品種的種苗繁育主要依靠扦插繁殖，尤其在商品化生產(chǎn)上。但扦插苗繁殖需要大量的插穗，繁殖速度慢、效率低、品種退化較快，且受季節(jié)等條件限制難以周年生產(chǎn)。而組織培養(yǎng)繁殖快，能在短期內(nèi)獲得大量的植株，還可保持品種的優(yōu)良性狀，不受季節(jié)條件限制，是種苗規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。1980年Hasegawa成功在MS培養(yǎng)基上建立了月季試管苗無(wú)性系，開(kāi)辟了月季組培的先河。近年來(lái)，月季的組織培養(yǎng)研究越來(lái)越多[1-8]?！_拉的組培快繁研究也有相關(guān)報(bào)道。俞艷芳等[9]以莖段為外植體成功建立了‘卡羅拉組培快繁體系，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基分別為：MS+0.80 mg/L6-BA、MS+2.00 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA、1/2MS+0.30 mg/L IBA。周艷等[10-11]以‘卡羅拉的不同器官為外植體進(jìn)行研究，結(jié)果表明：最適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)材料是莖段，芽誘導(dǎo)、繼代和生根培養(yǎng)基分別為1/2MS+1.50 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA、1/2MS+1.00 mg/L 6-BA+0.30 mg/L NAA和1/2MS+0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L IBA。瞿素萍[12]研究了5個(gè)切花月季品種葉片直接和間接再生2 種途徑，發(fā)現(xiàn)‘卡羅拉的直接再生能力、愈傷組織誘導(dǎo)率、間接分化率均高于其余4個(gè)切花品種。本試驗(yàn)以月季‘卡羅拉的莖段為外植體，研究了滅菌方式、不同培養(yǎng)基以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)劑種類和濃度對(duì)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響，以期建立該品種的快繁體系，為今后種苗繁殖提供有效途徑，為完善月季組培快繁技術(shù)以及大規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

月季品種‘卡羅拉。

1.2 方法

1.2.1 外植體表面滅菌 選取帶飽滿芽、無(wú)病蟲害的健康枝條，以帶1個(gè)芽的莖段為外植體，用少量洗衣粉或洗潔精浸泡并不斷搖勻，10 min后再用流水沖洗10 min，邊洗邊用毛刷將莖段表面刷干凈。然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)上，將洗凈的莖段按表1的組合方式進(jìn)行滅菌，每使用一種滅菌劑處理后均用無(wú)菌水沖洗莖段3次，再接入MS培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。每個(gè)處理的莖段接種數(shù)為20個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天觀察污染以及芽誘導(dǎo)情況，并統(tǒng)計(jì)，連續(xù)觀察10 d。計(jì)算公式如下：

污染率/%=污染數(shù)/接種數(shù)×100；

芽誘導(dǎo)率/%=芽萌發(fā)的莖段數(shù)/接種數(shù)×100。

培養(yǎng)條件：溫度（28±2）℃，光照時(shí)間每天12 h。下同。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 將從莖段上萌發(fā)的嫩芽切取下來(lái)，接入含有不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度的培養(yǎng)基上（表2）進(jìn)行增殖培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種量為40株，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天觀察生長(zhǎng)情況，繼代周期20 d。并計(jì)算增殖系數(shù)：增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種數(shù)。

WPM（木本培養(yǎng)基）培養(yǎng)基：配置1 L WPM培養(yǎng)基，稱取WPM培養(yǎng)基固體粉末2.14 g，另取硝酸鈣0.56 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，蔗糖為20 g/L，瓊脂3.5～4.0 g/L，pH為5.8～6.0。

1.2.3 生根培養(yǎng) 當(dāng)增殖出的小苗長(zhǎng)至高2.0～3.5 cm時(shí)，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中（表3）。每個(gè)處理接種量為25株，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天觀察生長(zhǎng)情況，并計(jì)算生根率：

生根率/%=生根數(shù)/接種數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)（Duncans 多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體表面滅菌

從表4可以看出，M1、M2、M3、M4、M7的污染率存在顯著差異，M5、M6、M8、M9的污染率無(wú)顯著差異，M5、M6、M8、M9的污染率均為0，顯著低于M1、M2、M3、M4、M7的污染率。在芽誘導(dǎo)率方面，M5的芽誘導(dǎo)率最高，為100.00%，顯著高于其余處理的芽誘導(dǎo)率，M1的芽誘導(dǎo)率最低，為13.33%，與M2差異不顯著，兩者均顯著低于其余處理的芽誘導(dǎo)率。由此表明，月季‘卡羅拉莖段的污染率和成活率因酒精和升汞的滅菌時(shí)間不同而有所不同。酒精滅菌時(shí)間為20 s時(shí)，污染率較高，但隨著升汞滅菌時(shí)間的增加顯著下降，而芽誘導(dǎo)率與污染率呈負(fù)相關(guān)；酒精滅菌時(shí)間為30 s或40 s時(shí)，污染率顯著下降，直至污染率為0，此時(shí)，芽誘導(dǎo)率隨著升汞時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，酒精和升汞的滅菌時(shí)間對(duì)芽誘導(dǎo)的成活影響很大，時(shí)間過(guò)短，污染率大，從而導(dǎo)致芽誘導(dǎo)率降低，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于滅菌劑的毒害極大地降低芽誘導(dǎo)率。綜上可得，適宜月季‘卡羅拉莖段表面滅菌的最佳組合是75%酒精滅菌30 s結(jié)合0.1%升汞處理10 min，污染率為0，芽誘導(dǎo)率為100.00%（圖1）。

2.2 增殖培養(yǎng)

從表5可以看出，新芽數(shù)的變化即是增殖系數(shù)的變化。Z7的增殖系數(shù)與其余7種處理存在顯著差異，為4.48，并顯著高于其他處理的增殖系數(shù)，Z1的增殖系數(shù)與其余7種處理存在顯著差異，為2.80，并顯著低于其他處理的增殖系數(shù)。Z3和Z1、Z2、Z4的增殖系數(shù)存在顯著差異，Z7與Z5、Z6、Z8的增殖系數(shù)有顯著差異。由此表明，不同的基本培養(yǎng)基對(duì)增殖系數(shù)的影響不同，以WPM為基本培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)的影響有顯著提高的作用。此外，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度組合對(duì)增殖培養(yǎng)也有影響。在相同的基本培養(yǎng)基上，以6-BA的濃度為3.0 mg/L，IBA的濃度為0.1 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)最高，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，植株健壯，其中以WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)的增殖系數(shù)達(dá)到最大。綜上可知，以WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行月季‘卡羅拉的增殖培養(yǎng)，其增殖效果高于MS的，最適宜增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是WPM+3.00 mg/L 6-BA +0.10 mg/L NAA，增殖系數(shù)為4.48，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，植株健壯（圖2）。

2.3 生根培養(yǎng)

由表6可知，G9的生根率與其余7種處理存在顯著差異，為96.00%，并顯著高于其他處理的生根率，G4的生根率與其余7種處理存在顯著差異，為62.67%，并顯著低于其他處理的生根率。G3、G4的生根率存在顯著差異，G1、G2、G5、G6之間的生根率無(wú)顯著差異，G7、G8、G10、G11、G12的生根率無(wú)顯著差異。由此表明，月季‘卡羅拉的生根誘導(dǎo)受基本培養(yǎng)基、IBA和NAA的濃度影響明顯。當(dāng)以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，IBA的濃度為0.30 mg/L時(shí)，生根率達(dá)最大，為88.00%，植株長(zhǎng)勢(shì)好，根粗壯，根約2.5～3.0 cm；當(dāng)以WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基G9的生根率為最高，植株生長(zhǎng)好，根系粗壯，根約3～4 cm。此外，進(jìn)一步分析可知，隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的升高，生根率升高，其中IBA的生根效果較NAA的生根效果好。綜上可知，以WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行月季‘卡羅拉的生根培養(yǎng)，其生根效果較MS的好，最適宜的生根培養(yǎng)基為WPM+0.30 mg/L IBA，生根率96.00%，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，主根平均長(zhǎng)度3～4 cm（圖3）。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以75%的酒精和0.1%的升汞為消毒藥劑，莖段表面滅菌的最佳組合是75%酒精滅菌30 s結(jié)合0.1%升汞處理10 min，污染率為0，芽誘導(dǎo)率為100.00%。這和前人的滅菌方法是相同[9-10]，但芽誘導(dǎo)率有一定的差異，例如周艷[10]滅菌后的芽誘導(dǎo)率為81.00%。出現(xiàn)這種差異的原因可能是：外植體自身的成熟度，組織培養(yǎng)的環(huán)境條件、培養(yǎng)基的組成、取材的季節(jié)等引起的。此外，通過(guò)本研究得出：外植體的表面滅菌受消毒藥劑的滅菌時(shí)間影響較大，在相同的酒精滅菌時(shí)間下，莖段的污染率隨著升汞滅菌時(shí)間的增加呈不斷下降趨勢(shì)的結(jié)果，而芽誘導(dǎo)率則表現(xiàn)為：在酒精滅菌時(shí)間為20 s時(shí)，誘導(dǎo)率隨著升汞滅菌時(shí)間的增加而上升，當(dāng)酒精滅菌時(shí)間為30、40 s時(shí)，芽誘導(dǎo)率隨著升汞滅菌時(shí)間的增加先上升后下降。酒精對(duì)植物材料的表面有浸潤(rùn)的作用，75%酒精的穿透力強(qiáng)，其滲透壓與細(xì)菌的滲透壓相近，可滲入菌體內(nèi)部，從而使細(xì)菌的所有蛋白脫水、變性凝固，最終殺死細(xì)菌，但同時(shí)也很容易殺傷植物細(xì)胞，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)破壞植物的內(nèi)部組織，導(dǎo)致嚴(yán)重失水而死，影響芽誘導(dǎo)率。升汞的消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使Hg2+與植物組織內(nèi)的硫基蛋白結(jié)合形成不可逆沉淀，使外植體失去活性而影響成活率。由此可見(jiàn)，滅菌時(shí)間過(guò)短，滅菌效果不佳，污染率偏高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然無(wú)污染，但是影響了芽誘導(dǎo)率。因此，掌握酒精和升汞的滅菌時(shí)間對(duì)無(wú)菌材料的獲得極為重要。

WPM是針對(duì)木本植物的培養(yǎng)基，目前關(guān)于WPM培養(yǎng)基在月季上的應(yīng)用不多。WPM與MS的成分區(qū)別在于：WPM培養(yǎng)基用K2SO4替換了MS培養(yǎng)基中的KNO3，NH4NO3的用量為MS培養(yǎng)基的1/4，氮鹽以CA（NO4）2的形式供應(yīng)。在本試驗(yàn)的增殖和生根培養(yǎng)研究中，以WPM為基本培養(yǎng)基對(duì)增殖系數(shù)、生根率均比MS的高。因?yàn)镸S培養(yǎng)基中鹽濃度過(guò)高，特別是氮鹽含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致生根不適應(yīng)，因此需要減少無(wú)機(jī)鹽用量[13]，而WPM是作為一種低鹽培養(yǎng)基，則有利于植株的生根。WPM有利于月季‘卡羅拉的增殖和生根培養(yǎng)，但在誘導(dǎo)豐花月季葉片的愈傷組織時(shí)，MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率比WPM的高[14]，可見(jiàn)，WPM對(duì)不同品種、不同培養(yǎng)階段的影響不同。WPM培養(yǎng)基對(duì)防止產(chǎn)生褐化具有較好的效果，李純佳[15]的研究表明WPM培養(yǎng)基是防止產(chǎn)生褐化的適宜基本培養(yǎng)基，主要原因在于：WPM培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽總含量較低，有利于減輕外植體褐變。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，少量新切取下來(lái)的嫩芽培養(yǎng)一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)植株死亡的情況，嚴(yán)重影響了繼代增殖的效果，但在WPM的培養(yǎng)基上無(wú)此情況出現(xiàn)，具體原因有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比是月季叢生芽增殖和生根的關(guān)鍵。在月季組織培養(yǎng)中，低濃度的6-BA有利于芽的增殖，高濃度對(duì)芽增殖有抑制作用，適宜的NAA濃度有利于芽和葉生長(zhǎng)，偏高則會(huì)產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于側(cè)芽的直接分化和生長(zhǎng)。6-BA的有效濃度為0.10～3.00 mg/L，NAA的有效濃度為0.005～0.5 mg/L、也有用到1.0～2.0 mg/L[16]，本實(shí)驗(yàn)6-BA濃度為3.00 mg/L ，NAA濃度為0.10 mg/L。在生根誘導(dǎo)過(guò)程中，隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的升高，生根率升高，其中IBA的生根效果較NAA的生根效果好。原因可能是：IBA移動(dòng)速度慢，是長(zhǎng)效化合物； NAA的生理活性雖高，但毒性較IBA高[17]。

綜上所述，以月季‘卡羅拉莖段為外植體，最佳表面滅菌的組合是75%酒精滅菌30 s結(jié)合0.1%升汞處理10 min，污染率為0，芽誘導(dǎo)率為100.00%。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，以WPM為基本培養(yǎng)基有利于各階段的培養(yǎng)，最適宜增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是WPM+3.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，增殖系數(shù)為4.48，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，植株健壯；最適宜的生根培養(yǎng)基為WPM+0.30 mg/L IBA，生根率96.00%，小苗長(zhǎng)勢(shì)好，主根平均長(zhǎng)度3～4 cm。

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