閆海霞 蔣月喜 鄧杰玲 黃昌艷 王曉國 何荊洲 卜朝陽

摘要：【目的】研究3種東方百合離體培養(yǎng)技術，篩選出適宜其離體培養(yǎng)的統(tǒng)一培養(yǎng)基，為東方百合工廠化育苗提供技術保障。【方法】以3種東方百合提伯、索邦和西伯利亞的鱗片為外植體，篩選適宜的滅菌方法；在MS基本培養(yǎng)基上添加不同種類和不同濃度的激素，篩選適宜的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，進一步篩選最適移栽基質(zhì)?！窘Y果】適宜3種東方百合外植體滅菌的較好方法是：75%酒精滅菌15 s結合升汞滅菌12 min；愈傷誘導和分化的適宜培養(yǎng)基為MS；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，提伯、索邦和西伯利亞的增殖系數(shù)分別為3.32、3.32和3.00；MS+0.1 mg/L IBA是生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，提伯、索邦和西伯利亞的生根率分別為96.33%、92.67%和93.67%；移栽的最佳基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖（體積比）=2∶1，提伯、索邦和西伯利亞的移栽成活率分別為97.34%、98.00%和100.00%。【結論】建立的3種東方百合離體快繁體系適用于東方百合種球工廠化生產(chǎn)。

關鍵詞： 東方百合；外植體；離體培養(yǎng)；培養(yǎng)基

中圖分類號： S682.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0889-06

0 引言

【研究意義】百合（Lilium spp.）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium L.）多年生植物。近年來，切花百合在市場上極受歡迎，應用前景廣闊，尤其是東方百合在國內(nèi)外市場的需求量極大。在百合切花生產(chǎn)上，我國商品化種球主要依靠國外進口，存在成本高及攜帶他國病毒風險高等問題。因此，優(yōu)化百合種球繁育技術是降低成本、避免他國病毒入侵的有效途徑。分球繁殖是百合常用的繁殖方法，但繁殖系數(shù)低，且易因病毒等病原積累危害引起種球品質(zhì)退化等問題，不利于工廠化、規(guī)?；a(chǎn)，而采用離體培養(yǎng)技術可解決此類問題?！厩叭搜芯窟M展】近年來，國內(nèi)學者對多種百合進行了離體培養(yǎng)研究（黃惠英，2000；何家濤和王會，2007；雷家軍等，2008；雷家軍和徐瑩，2013），成果顯著，極受市場歡迎的東方百合離體培養(yǎng)研究也逐漸增多（唐東芹等，2003；龐新霞等，2008；蒲秀琴等，2008；鄭潔等，2015）。付文奇等（2008）研究表明，NAA誘導東方百合離體鱗片外植體產(chǎn)生小鱗莖的最佳用量為0.69 mg/L；2，4-D誘導愈傷組織的最佳用量為3.2 mg/L。楊美純等（2008）以東方百合馬可波羅的花被片、花絲、花托、子房為外植體，研究不同激素組合對花器官各部位不定芽誘導率、芽增殖率及生根率的影響，結果表明，花托、花被片、花絲及子房誘導產(chǎn)生叢芽的最佳培養(yǎng)基分別為：MS+6-BA 0.5～3.0 mg/L+ NAA 0.1～0.2 mg/L、MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L、MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；生根結鱗莖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+糖50～80 g/L+NAA 0.4～0.8 mg/L。趙得萍等（2008）以東方百合索邦的花萼、花瓣和花絲為外植體進行花器官誘導能力與再分化能力比較，結果表明，花萼的愈傷誘導率和不定芽再分化率最高，分別為92.0%和89.0%，花瓣次之，花絲最低；花絲分段培養(yǎng)的最佳誘導培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，花絲各部位分化能力表現(xiàn)為中部>基部>頂部，中部花絲在MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上的愈傷誘導率和不定芽再分化率均達100.0%。崔祺和賈桂霞（2014）對東方百合索邦、野生淡黃花百合及新鐵炮百合雷山3號的組織培養(yǎng)結果表明，淡黃花百合種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖；索邦、雷山3號的不定芽誘導培養(yǎng)基分別為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；3種百合的增殖培養(yǎng)基為MS+

2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；適宜索邦無菌苗鱗莖增大的培養(yǎng)基為MS+0.5 g/L活性炭+3.0 mg/L PP333+80 g/L蔗糖。【本研究切入點】目前，東方百合離體培養(yǎng)研究雖然取得了較大進展，報道了許多適宜的培養(yǎng)基配方（劉雅莉等，2004；張延龍等，2004；張藝萍等，2008），但培養(yǎng)基配方各不相同，缺乏統(tǒng)一的適宜培養(yǎng)基配方，結果的重現(xiàn)性差?！緮M解決的關鍵問題】以3種東方百合主栽品種提伯、索邦和西伯利亞為材料進行離體培養(yǎng)研究，篩選出最適合的統(tǒng)一培養(yǎng)基，以解決組培重現(xiàn)性差的問題，為東方百合的大批量快速生產(chǎn)提供技術保障。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

供試東方百合品種：提伯（Tiber）、索邦（Sorbonne）、西伯利亞（Siberi）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 外植體滅菌 以自來水沖洗掉百合種球的泥團后剝?nèi)プ钔鈱喻[片，用中性洗滌劑漂洗5 min，再用流水沖洗30 min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺，進行不同滅菌處理方式試驗：先用75%酒精滅菌15或30 s，無菌水沖洗3遍，再用0.1% HgCl2滅菌8或12 min，無菌水沖洗3次，將百合鱗片切成小塊，然后接種在MS培養(yǎng)基上。每天觀察其生長情況，20 d后統(tǒng)計污染及成活情況。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度（25±1）℃，光照12～16 h，光照強度1500～2000 lx（以下涉及的組織培養(yǎng)條件均與此相同）。

1. 2. 2 愈傷組織誘導及分化培養(yǎng) 將成活的鱗片接入不添加任何生長激素的MS培養(yǎng)基上，20 d后觀察統(tǒng)計愈傷組織誘導及愈傷分化情況。

1. 2. 3 增殖培養(yǎng) 將產(chǎn)生的小鱗莖接入添加不同種類和不同濃度激素組合（0.5 mg/L 6-BA、0～1.0 mg/L NAA和0～1.0 mg/L IBA）的培養(yǎng)基中，20 d后觀察統(tǒng)計增殖情況，篩選出最適增殖培養(yǎng)基。

增殖系數(shù)=新芽數(shù)/接種數(shù)

1. 2. 4 生根培養(yǎng) 將生長健壯的植株接入到生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基以1/2MS或MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度（0.1、0.5 mg/L）IBA，15 d后統(tǒng)計生根情況，篩選出最適生根培養(yǎng)基。

生根率（%）=生根數(shù)/接種數(shù)×100

1. 2. 5 煉苗移栽 將生根良好的組培苗移出培養(yǎng)室并置于室溫下煉苗3 d，然后向瓶內(nèi)加少許水（以剛沒過培養(yǎng)基為宜），繼續(xù)煉苗1～2 d，小心取出小苗，冼凈基部培養(yǎng)基，用多菌靈可濕性粉劑800～1000倍液或0.05%高錳酸鉀溶液浸泡10 min，取出在陰涼處晾10～15 min后移栽到3種基質(zhì)中（表1），澆透水，15 d后統(tǒng)計移栽成活率，篩選出最適移栽基質(zhì)。

成活率（%）=成活數(shù)/移栽數(shù)×100

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0對試驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2. 1 不同滅菌處理方式對東方百合外植體的影響

從表2可以看出，3種東方百合的外植體滅菌效果與酒精及升汞的滅菌時間密切相關。隨著酒精滅菌時間的增加，3個品種的污染率雖然有所下降，但成活率也在降低；當酒精滅菌時間為15 s時，隨著升汞滅菌時間的增加，3個品種的污染率降低、成活率提高；當酒精滅菌時間為30 s時，隨著升汞滅菌時間的增加，污染率雖然為0，但成活率降低；采用75%酒精滅菌15 s結合升汞滅菌12 min的方法，提伯、索邦和西伯利亞的污染率較低，分別為5.56%、9.38%和6.45%，成活率較高，分別達94.44%、90.62%和93.55%；當升汞滅菌時間為8 min時，3個品種的污染率上升、成活率降低；采用75%酒精滅菌30 s結合升汞滅菌12 min時，3個品種的污染率雖然為0，但成活率也降至最低；當升汞滅菌時間為8 min時，3個品種的滅菌效果仍不理想?？梢姡捎?5%酒精滅菌15 s結合升汞滅菌12 min是最適宜的外植體滅菌方法。

2. 3 增殖培養(yǎng)基篩選結果

由表4可知，4種增殖培養(yǎng)基對百合品種不具選擇性，均能使3個百合品種發(fā)生增殖，但增殖系數(shù)各不相同，生長情況也存在差異。其中，在培養(yǎng)基1上，提伯、索邦和西伯利亞的增殖系數(shù)分別為3.32、3.32和3.00，均顯著高于其他培養(yǎng)基（P<0.05，下同），且植株生長狀況好，苗健壯；而在培養(yǎng)基4上，提伯、索邦和西伯利亞的增殖系數(shù)均最低，分別為2.12、2.12和2.24，植株長勢一般或差，表現(xiàn)為葉片黃化、苗細弱等。綜合增殖系數(shù)的高低及植株生長情況，3種東方百合增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

2. 4 生根培養(yǎng)基篩選結果

由表5可知，4種生根培養(yǎng)基對百合品種不具選擇性，3種東方百合在添加不同濃度IBA的培養(yǎng)基上均可誘導生根，但生根率和植株生長情況不同。其中，培養(yǎng)基1的提伯生根率最高，為96.33%，顯著高于除培養(yǎng)基3外的其他培養(yǎng)基，且植株長勢好，根系粗壯，長約2.0 cm；培養(yǎng)基3的生根率次之，為92.00%，與其他3個培養(yǎng)基的差異不顯著（P>0.05，下同），植株長勢好，長約1.0 cm。不同培養(yǎng)基處理索邦和西伯利亞生根率無顯著差異，但均以培養(yǎng)基1的生根率最高，分別為92.67%和93.67%，植株根系均較粗壯。從表5還可以看出，在同一品種中，當IBA濃度一致時，隨著大量元素和蔗糖添加量的減少，其生根率也隨之降低?？梢姡罅吭睾驼崽菍?種東方百合的生根培養(yǎng)有較大影響。綜合植株生根率的高低及植株生長、生根情況，3種東方百合的適宜生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA。

2. 5 煉苗移栽基質(zhì)篩選結果

由表6可知，3種基質(zhì)對百合品種不具選擇性，3種東方百合移栽在不同的基質(zhì)上均可成活，但不同基質(zhì)下植株的成活率不同。提伯、索邦和西伯利亞在基質(zhì)1中的移栽成活率均最高，分別為97.34%、98.00%和100.00%，均顯著高于基質(zhì)3，但與基質(zhì)2的差異不顯著，此時百合植株健壯，長勢旺盛；采用基質(zhì)2時，3個品種的移栽成活率均有下降，且植株長勢緩慢；采用基質(zhì)3時，3個品種的植株長勢均較差，移栽成活率也明顯降低，分別為83.34%、80.66%和82.66%?？梢?，最適合3種東方百合移栽的基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖=2∶1。

3 討論

本研究外植體采用75%酒精滅菌15 s結合0.1% HgCl2滅菌12 min，可確保較高的成活率和較低的污染率，提伯、索邦和西伯利亞的污染率分別為5.56%、9.38%和6.45%，成活率分別達94.44%、90.62%和93.55%，與前人的研究結果（雷家軍等，2008；付娜等，2010）較接近。雷家軍等（2008）研究表明，百合鱗片的最佳滅菌方法是0.1% HgCl2滅菌8 min，污染率較低，為11.0%，而成活率最高可達88.0%；付娜等（2010）采用75%酒精浸泡20 s后用0.1%升汞滅菌12 min處理龍牙百合珠芽的效果最好，外植體污染率較低，成活率較高。從本研究結果可知，外植體滅菌效果受酒精滅菌時間影響較大，隨著酒精滅菌時間的增加污染率雖然有所下降，但成活率也隨之降低，主要原因在于酒精浸泡時間過長，其較強的穿透力不但使菌體蛋白質(zhì)變性，而且使植物蛋白發(fā)生不可逆的變性而死亡，導致外植體成活率降低。但也有較長時間的酒精滅菌結合較長時間的HgCl2滅菌方法，如何林（2007）采用75%酒精滅菌90 s、0.1%升汞滅菌13 min處理百合鱗片外植體，可把污染率降低到10%，并獲得83.3%的誘導率。產(chǎn)生此差異的原因可能與所取材料成熟度、部位或材料自身的差異等有關?？梢姡庵搀w的滅菌時間需控制在一個合適的范圍內(nèi)才能獲得較好的滅菌效果。

隨著切花百合在市場的走俏，其需求量越來越大，對百合種球的需求也逐漸增加，使種球繁育面臨嚴峻的形勢和壓力，而篩選出適宜的培養(yǎng)基可有效緩解種苗繁育壓力。目前百合的組培快繁存在重現(xiàn)性差的問題，即不同研究所報道的適宜培養(yǎng)基配方不同。如針對提伯，不同研究的適宜增殖培養(yǎng)基不同，有MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA（何林，2007）或MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（盧賽清，2007）；索邦的最佳增殖培養(yǎng)基有MS+l.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA（何林，2007）或MS+0.4 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA（盧賽清，2007）。產(chǎn)生這種差異的原因：一是外植體個體本身存在差異；二是培養(yǎng)基的差異，由于藥品的出廠批次或培養(yǎng)基制成的精確度不同所造成差異；三是由于不同地域培養(yǎng)的環(huán)境條件不同而產(chǎn)生的差異等。本研究通過多次試驗，篩選出適合3種東方百合離體培養(yǎng)的統(tǒng)一培養(yǎng)基，為東方百合種苗的工廠化生產(chǎn)提供了技術保障。

4 結論

本研究結果表明，適合3種東方百合離體培養(yǎng)的外植體滅菌消毒最適方法為：75%酒精滅菌15 s結合升汞滅菌12 min；愈傷誘導和分化的適宜培養(yǎng)基為MS；增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；生根的最適培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA；移栽最佳基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖（體積比）=2∶1。本研究建立的離體快繁技術體系適用于東方百合種球工廠化生產(chǎn)。

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（責任編輯 鄧慧靈）