程漢　張燕燕　蔡海濱　安澤偉　胡彥師　黃華孫

摘 要 通過橡膠樹低溫誘導(dǎo)全長cDNA文庫，構(gòu)建了1個含有11 708個Unigene的cDNA陣列。使用這些cDNA陣列對橡膠樹抗寒品種93-114和低溫敏感種質(zhì)材料熱墾501進行基因表達譜研究。結(jié)果表明，在低溫誘導(dǎo)情況下，共有84個基因差異表達，其中52個上調(diào)表達，32個下調(diào)表達。在抗寒品種和低溫敏感種質(zhì)材料間的差異基因有21個，其中在93-114中上調(diào)的有12個，下調(diào)的有9個。進一步對這些基因進行了功能注釋。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；cDNA文庫；cDNA陣列；抗寒；差異基因

中圖分類號 Q78；S794.1 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract The rubber tree cDNA arrays containing 11 708 unigenes were constructed using a cold inducing cDNA library. The arrays were used to study the gene expression in rubber tree cold resistant clone 93-114 and cold sensitive clone Reken 501. The results demonstrated that 84 genes differentially expressed under cold treatment， in which 52 genes were up-regulated， while 32 down-regulated. The differentially expressing gene number between 93-114 and Reken 501 was 21， in which 12 genes were highly expressed and 9 lowly expressed in 93-114. These genes were further functionally annotated. This study provides empirical evidence for the development of gene microarray in rubber tree， and also contribute the data for the identification of cold resistant genes in Hevea brasiliensis.

Key words Hevea brasiliensis； cDNA library； cDNA array； Cold resistance； Differential gene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.007

低溫是影響植物分布、生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境限制因子。對于原產(chǎn)于亞馬遜河流域的巴西橡膠樹來說，低溫更是限制其地理分布的重要因子。在我國，適宜種植橡膠的栽培區(qū)域主要分布在海南、云南和廣東等熱帶北緣地區(qū)，低溫寒害每年都會發(fā)生，嚴(yán)重影響到橡膠樹的產(chǎn)量及其經(jīng)濟壽命，特別是較大寒潮來襲時，往往有成片膠園遭受毀滅性的破壞。因此，低溫寒害是制約我國橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要的環(huán)境限制因子。

近年來，借助分子生物學(xué)手段，植物抗寒機制研究進展迅速。目前已經(jīng)分離鑒定出一系列低溫誘導(dǎo)功能基因，同時也發(fā)現(xiàn)多條低溫信號途徑[1-7]。然而這些研究大多集中在擬南芥等溫帶植物中，在非低溫馴化植物如熱帶起源的橡膠樹中的研究較少。在多條冷誘導(dǎo)途徑中，擬南芥的CBF信號途徑研究較為透徹[5，8-9]。然而由于植物抗寒是個復(fù)雜性狀，是多個基因協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，在抗寒育種中轉(zhuǎn)入單個抗寒基因往往達不到較好的抗寒效果。因此，要想有效地提高植物的抗寒性，必須深入研究植物感受和傳導(dǎo)低溫信號的機制，以及植物抗寒的分子機理。進一步探索植物抗寒機理不僅在理論上具有重要意義，在生產(chǎn)實踐中也具有廣泛的應(yīng)用價值。

本研究以低溫誘導(dǎo)巴西橡膠樹cDNA文庫為基礎(chǔ)[10]，利用cDNA陣列的方法，從巴西橡膠樹低溫cDNA文庫中篩選冷應(yīng)答基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一些抗寒相關(guān)基因，分析其功能及各個基因之間的相互關(guān)系，為研究橡膠樹抗寒脅迫的分子機理打下基礎(chǔ)，并最終為橡膠樹抗寒分子輔助育種提供理論依據(jù)和基因材料準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用巴西橡膠樹93-114、熱墾501，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所橡膠樹國家種質(zhì)資源圃提供。93-114是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院從雜交組合天任31-45×合口3-11中選育的抗寒品種，熱墾501是引進的低溫敏感材料，來自RRIM600×PB260雜交組合。二者間沒有共同父母本，相對親緣關(guān)系較遠。以抗寒品種93-114和低溫敏感材料熱墾501進行低溫和常溫對照兩種處理。常溫處理在大棚內(nèi)溫度為28 ℃，低溫處理方法是當(dāng)苗木長至第二蓬葉穩(wěn)定時，在人工氣候箱中4 ℃處理24 h。葉片用液氮收集，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 cDNA陣列的制備 從構(gòu)建的巴西橡膠樹低溫誘導(dǎo)全長cDNA文庫中選取11 708個Unigene，將其代表的cDNA克隆合并轉(zhuǎn)移-至新的384孔板，形成核心cDNA文庫。將這些核心cDNA文庫在尼龍膜上形成cDNA陣列，具體方法如下：

在384孔板中加入50 μL LB培養(yǎng)基，將核心cDNA文庫接種至已經(jīng)編好順序的384孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中100 r/min震蕩培養(yǎng)16～20 h。使用384孔針將養(yǎng)好的cDNA克隆點在12 cm×8 cm帶正電的硝酸纖維尼龍膜（Hybond-N+，英國Amersham Pharmacia biotech公司）上形成cDNA陣列，放入已倒好固體LB的培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。之后進行膜上裂解提取DNA，包括膜上質(zhì)粒裂解變性、中和、洗去細胞碎片。具體操作步驟如下：把膜正面朝上依次放入已經(jīng)加好下列溶液的放有3MM層析紙的平底容器里，所有溶液應(yīng)剛好浸濕3MM層析紙，依次進行下面操作：（1）10% SDS 3 min；（2）變性液5 min；（3）中和液5 min；（4）2×SSC，0.1% SDS 5 min；（5）2×SSC 5 min；（6）0.4 mol/L NaOH 20 min。然后在平底容器里依次加入下列溶液，所加溶液量應(yīng)能淹沒尼龍膜，并在搖床上洗滌：（7）5×SSC，0.1% SDS 20 min；（8）5×SSC，0.1% SDS 20 min；（9）2×SSC 10 min；（10）2×SSC 10 min。

最后進行紫外交聯(lián)固定。用濾紙吸去尼龍膜上多余水分。風(fēng)干后，將尼龍膜置于一張干的3MM濾紙上，用紫外交聯(lián)儀1.2 J/cm2照射。徹底干燥后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 探針制備 利用CTAB法提取橡膠樹葉片總RNA，每個樣品使用2 μg總RNA進行探針制備。先用Oligo（dT）18引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過純化后，使用Roche地高辛標(biāo)記與檢測試劑盒（Roche Applied Science，美國），進行標(biāo)記。檢測探針的標(biāo)記效率，將探針稀釋至1 ng/μL后備用。

1.2.3 雜交洗滌 cDNA陣列的雜交采用地高辛雜交試劑盒進行（Roche Applied Science，美國）。預(yù)雜交和雜交溫度為42 ℃，洗膜溫度為65 ℃。洗膜完成后，使用地高辛檢測試劑盒（Roche Applied Science，美國）進行信號檢測、曝光成像。

1.2.4 圖片掃描及數(shù)據(jù)獲取 用光密度掃描儀GS800掃描雜交顯影后的X光膠片，用PDQuestTM 2-D Analysis Software（Bio-Rad，美國）軟件分析每個雜交點，讀取每個雜交點的灰度值，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。每張384點的矩陣上均勻分布了5個ACTIN管家基因作為內(nèi)參。使用內(nèi)參基因的灰度值進行均一化處理。均一化處理后，得到每個Unigene的校正灰度值。對校正灰度值取對數(shù)，降低數(shù)據(jù)間的偏差。然后計算同類型樣本間的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值，用標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值得出數(shù)值的偏差范圍，如果同類型間偏差過大，則拋棄該數(shù)值，以減少假陽性。設(shè)置偏差取值范圍R≤0.5或R≥2。最后進行方差分析，選取p<0.05且R≤0.5或R≥2的Unigene。對其糾正灰度值取對數(shù)，算出低溫和常溫處理的比值，定義差異比值大于2倍為差異表達基因，即比值大于等于2為上調(diào)表達，小于等于0.5為下調(diào)表達。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 基因注釋使用本地化的BlastX進行。聚類分析使用R程序包進行，聚類熱圖使用R語言中g(shù)plots程序包。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA陣列的質(zhì)量監(jiān)控和表達數(shù)據(jù)獲取

圖1是一張代表性的cDNA雜交矩陣圖。圖中信號強度高，背景較為均一，沒有明顯缺陷。每張雜交圖中包含24×16個雜交斑點，分別代表了384個基因在該樣品中的表達水平。本實驗共完成了巴西橡膠樹低溫誘導(dǎo)全長cDNA文庫中11 708個Unigene在93-114和熱墾501的低溫和常溫下的表達分析，每個樣品材料得到31張雜交圖，共124張雜交信號圖。圖中個別雜交斑點出現(xiàn)了信號過強從而導(dǎo)致斑點過大的問題，在后期分析中采用手工修正的方法，對這些斑點的識別區(qū)域進行了調(diào)整，以避免機器自動識別的偏差。

2.2 橡膠樹低溫誘導(dǎo)文庫Unigene表達譜分析

使用經(jīng)過均一化處理后的橡膠樹表達數(shù)據(jù)進行聚類分析，基因間的相似分值使用Pearson相關(guān)分析得到，樣品間相似分值使用Spearman相關(guān)分析得到。從圖2可以看出，在所使用的4個樣品中，經(jīng)過低溫處理后的93-114和熱墾501的表達譜數(shù)據(jù)以及常溫下的93-114和熱墾501聚在一起。表明在橡膠樹低溫敏感材料熱墾501和抗寒品種93-114中，低溫處理對于基因表達譜的影響明顯超過了材料之間的差異，從而進一步說明，橡膠樹品種抗寒性狀很可能是由少數(shù)基因決定的。

2.3 低溫脅迫和常溫條件的基因表達差異分析

分析橡膠樹低溫脅迫和常溫條件下的基因表達差異情況，總共發(fā)現(xiàn)了84個差異表達的基因，其中52個基因上調(diào)表達，32個下調(diào)表達。上調(diào)表達基因中，有9個注釋為已知功能基因，20個注釋功能不清楚，21個是未能注釋的新基因。在32個下調(diào)表達基因中，能注釋為已知功能的有8個，注釋為未知功能的有16個，未能注釋的新基因有8個。詳細結(jié)果如表1和表2所示。

根據(jù)功能分類，可將52條上調(diào)表達的差異基因歸為以下三類： （1）新陳代謝相關(guān)基因，包括質(zhì)體藍素A、烯酰-CoA水合酶/異構(gòu)酶家族蛋白、氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白、烯醇酶2、乳酰谷胱甘肽裂解酶/乙二醛酶I、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶等；（2）信息儲存與處理，包括核仁RNA結(jié)合蛋白Nop10p家族蛋白、延生因子2（EF-2）、內(nèi)皮分化相關(guān)因子1（EDF-1）等；（3）功能未知，核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白（RGGA）、馬鈴薯塊莖類似蛋白、線粒體基質(zhì)載體家族蛋白、tRNA/rRNA甲基化酶家族蛋白（SpoU）、內(nèi)膜家族蛋白、60S酸性核糖體蛋白P3等。

32條下調(diào)表達基因大概可以歸為下述幾類：（1）新陳代謝（Metabolism），包括乙醇脫氫酶1、?；d體蛋白、線粒體前體蛋白（ACP）等；（2）細胞過程和信號（Cell processes and singnaling），包括ATP依賴的Clp蛋白酶ATP結(jié)合亞基（ClpC1）、肽基脯氨?；樖椒词疆悩?gòu)酶（CYP19-4）前體、蔗糖異構(gòu)酶蛋白等；（3）信息儲存和處理，60S核糖體蛋白L9-2、真核起始因子4A、60S酸性核糖體蛋白P1（L12）等；（4）功能未知，U盒結(jié)構(gòu)域蛋白、葉綠素a-b結(jié)合蛋白40、Dof型鋅指蛋白、寡聚多糖轉(zhuǎn)移酶STT3亞基、亮氨酸富含重復(fù)蛋白、NAM家族蛋白等。

2.4 低溫抗性與敏感橡膠品種差異表達分析

在抗寒材料與低溫敏感材料基因表達差異分析中，總共檢測到21個差異表達基因，其中12個在抗寒材料中上調(diào)表達，9個下調(diào)表達。上調(diào)表達的12個差異基因中，只有1個基因注釋為已知功能，8個功能注釋為未知，另外有3個未能成功注釋。下調(diào)表達的9個差異基因中，注釋為已知功能的有2個，注釋為未知功能的有3個，未能成功注釋的新基因有4個。上調(diào)和下調(diào)表達的已知基因信息詳見表3和表4。從差異基因數(shù)量和注釋情況來看，橡膠樹品系間差異明顯較低溫脅迫處理小。這可能與橡膠樹遺傳背景單一，品系間親緣關(guān)系相近有關(guān)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的研究手段層出不窮。已經(jīng)從過去的克隆單個基因進入組學(xué)時代?；蛐酒⑥D(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)的應(yīng)用，更是大大推動基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。然而，這些新技術(shù)方法往往在研究較為透徹的模式生物中應(yīng)用較廣，而在橡膠樹等研究較為落后的非模式生物中研究較為落后。雖然轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用，大大推進了橡膠樹基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究[11-14]，然而由于橡膠樹基因組測序未能有較大突破，嚴(yán)重阻礙了上述研究數(shù)據(jù)的進一步分析和應(yīng)用?；蛐酒夹g(shù)通過特定算法，能針對特定基因分析其表達、轉(zhuǎn)錄后編輯和拼接等信息，具有針對性強、通量高等特點， 在二代測序技術(shù)廣泛應(yīng)用的今天，仍然有較高的應(yīng)用價值。然而，基因芯片的設(shè)計和制作需要大量的前期基礎(chǔ)工作。

本研究通過cDNA陣列的方法，探索了在橡膠樹中使用生物芯片研究基因表達的可行性，分析得到84個在低溫表達前后有差異表達的基因，以及21個在抗寒和低溫敏感材料間有差異表達的基因。本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達基因數(shù)目較少，究其原因，一方面原因可能是技術(shù)層面上，使用384針手工點膜，相對誤差較大。菌落在尼龍膜上的生長不完全一致，后續(xù)的裂解和洗滌會造成尼龍膜上部分克隆丟失，因而造成數(shù)據(jù)缺失或偏差過大。另一方面，在后續(xù)數(shù)據(jù)分析上，筆者采用了較為嚴(yán)謹?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。只有在ttest分析達到顯著性差異（p<0.05）且基因表達差異達到2倍以上（R≤0.5或R≥2）時才被認定為差異表達基因。從橡膠樹本身來說，低溫誘導(dǎo)和抗寒相關(guān)基因數(shù)目可能偏少，也是造成差異基因數(shù)量少的一個原因。在對所分析的樣品表達譜數(shù)據(jù)進行聚類時發(fā)現(xiàn)，低溫處理對表達譜所造成的影響遠遠大于品種之間的差異。低溫誘導(dǎo)差異基因數(shù)目（84個）大于抗性差異品種之間的差異基因數(shù)目（21個），也從側(cè)面證明了上述觀點。

從差異表達基因類別來看，低溫脅迫引起上調(diào)基因主要為代謝相關(guān)基因、信息處理相關(guān)基因等。其中低溫脅迫下質(zhì)體藍素基因高表達，可能是在低溫下植物光和作用加強，合成更多的能量以應(yīng)對不良環(huán)境的影響。而烯脂酰輔酶A水化酶則參與脂肪酸β-氧化，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)該基因突變會造成植株抗寒能力下降，而過量表達則能增強轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力[15]。烯醇酶和蔗糖合成酶參與碳水化合物代謝，為植物提供能量。其中烯醇酶可以催化磷酸甘油酸脫水形成磷酸烯醇式丙酮酸，該反應(yīng)是糖酵解途徑中唯一的一步脫水反應(yīng)。有研究表明，植物在厭氧、高鹽、干旱、低溫等脅迫條件下，烯醇酶基因的表達量及酶活均會產(chǎn)生相應(yīng)的變化，從而為逆境條件下植物產(chǎn)生大量自由基而導(dǎo)致的光合系統(tǒng)損傷的修復(fù)提供能量。因而該基因被廣泛認為是與植物抗逆性相關(guān)的基因。一些研究發(fā)現(xiàn)玉米在厭氧條件下烯醇酶的轉(zhuǎn)錄水平和酶活均會有明顯的提高，油菜在鹽誘導(dǎo)的條件下烯醇酶基因的表達量也會有所提高。在擬南芥中烯醇酶由LOS2基因編碼，參與低溫反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活[16]。乙二醛酶是一種胞內(nèi)酶，能夠分解植物體內(nèi)的乙二醛，從而減輕非生物脅迫產(chǎn)生的醛基毒害。將香蕉的乙二醛酶基因在釀酒酵母中增強表達，能夠提高其對非生物脅迫的抵抗能力[17]。綜上，從這些上調(diào)基因的生物學(xué)功能來看，它們很可能從各自不同的生物學(xué)途徑參與了橡膠樹的抗寒反應(yīng)。

然而由于抗寒性狀的復(fù)雜性，可能涉及到多個生物學(xué)途徑。本研究由于在技術(shù)方面存在限制，未能大規(guī)模發(fā)掘抗寒相關(guān)基因。采用新的技術(shù)手段，特別是第二代測序技術(shù)在橡膠樹中系統(tǒng)應(yīng)用，無疑能大大推進橡膠樹抗寒性狀研究，發(fā)掘更多的抗寒相關(guān)基因。另外，對本研究初步發(fā)掘的抗寒相關(guān)基因——特別是低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達基因，進行深入研究，也將為橡膠樹抗寒機理研究補充新的內(nèi)容。

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