農(nóng)志歡 張啟偉 楊平 何飛 曾憲彪 蘇華 韋寶偉 唐毓凡 毛長(zhǎng)智 韋桂寧

摘要：【目的】分析十大功勞屬6個(gè)種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為其資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎杉蠊趯?個(gè)種植物樣品，提取基因組DNA，采用優(yōu)化的RAPD反應(yīng)體系和條件進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，分析多態(tài)性條帶規(guī)律，并用NTSYS-pc Version 2.11a進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，生成聚類(lèi)圖。【結(jié)果】十大功勞屬6個(gè)種的21條重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的有效引物共擴(kuò)增出264條條帶，其中多態(tài)性條帶234條，多態(tài)性比例為88.64%，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.373～0.414；6個(gè)種的遺傳相似系數(shù)為0.45～0.78。UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)0.53處，6個(gè)種可分為3個(gè)組，其中闊葉十大功勞M. bealei和小果十大功勞M. bodinieri Gagnep.為一組，靖西全緣葉十大功勞M. jingxiensis為一組，其他3個(gè)種為一組；在遺傳相似系數(shù)0.59處，細(xì)葉十大功勞M. fortunei單獨(dú)為一組，長(zhǎng)柱十大功勞M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功勞M. subimbricata W. Y. Chun et F. Chun為一組?！窘Y(jié)論】十大功勞屬6個(gè)種植物具有較豐富的遺傳多樣性，部分種之間有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 十大功勞；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；RAPD；聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1077-06

0 引言

【研究意義】十大功勞是小檗科十大功勞屬（Mahonia）植物，擁有約60個(gè)種，其中在我國(guó)發(fā)現(xiàn)有35個(gè)種，主要分布在廣西、四川、云南及西藏等地（余天虹等，2015）。十大功勞有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，可用于治療濕熱瀉痢、黃疸、目赤腫痛、胃火牙痛、痢疾及黃疸型肝炎等（陳明生等，2014），藥用價(jià)值極高，是“功勞去火片”、“婦科千金片”等中藥制劑或中成藥的主要原料（He and Mu，2015），市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，而目前能用于制藥的十大功勞僅有闊葉十大功勞（Mahonia bealei）或細(xì)葉十大功勞（M. fortunei）的干燥莖，其資源極其缺乏，且極少人工大面積種植。因此，研究十大功勞的種質(zhì)遺傳多樣性，明確不同種十大功勞間的親緣關(guān)系，以尋找闊葉十大功勞或細(xì)葉十大功勞的替代品，擴(kuò)大功勞木的藥材來(lái)源，對(duì)其資源的保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是一種以電泳和PCR為核心的分子標(biāo)記技術(shù)（蔣向輝和佘朝文，2011；楊學(xué)明等，2011），具有靈敏度高、模板用量少、成本低、獲取信息量大等優(yōu)點(diǎn)（陳集成等，2014），目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物資源鑒定、親緣關(guān)系分析及遺傳多樣性分析等（張敏瑩等，2013；陳天青等，2015；蘭琴英等，2015）。Esmaeelkhanian等（2007）運(yùn)用RAPD分析方法對(duì)伊朗6個(gè)品種山羊的遺傳多樣進(jìn)行分析，確定其親緣關(guān)系，并得到了聚類(lèi)分析圖。Khan等（2008）研究表明，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)能簡(jiǎn)單快速地分析野生芥菜（Brassica juncea）的親緣關(guān)系和種質(zhì)遺傳變異情況。朱學(xué)峰（2011）提取7只廣西中華草龜?shù)幕蚪MDNA，利用RAPD技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，為廣西草龜資源的合理開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)。江文等（2012）利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析了24個(gè)荸薺地方品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，為荸薺品種資源研究和選育提供理論依據(jù)。徐婧等（2012）采用單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)闊葉十大功勞ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，為探討闊葉十大功勞種質(zhì)遺傳多樣性打下了基礎(chǔ)。夏葉等（2014）通過(guò)ITS2測(cè)序建立了十大功勞與其近緣易混品種的鑒別方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于十大功勞的研究主要集中在藥效方面（Miyasaki et al.，2013；Zhang et al.，2014），針對(duì)遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用RAPD分析方法對(duì)6個(gè)種十大功勞進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，為十大功勞藥材資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

十大功勞屬6個(gè)種分別為細(xì)葉十大功勞M. fortunei、小果十大功勞M. bodinieri Gagnep.（采集于南寧市廣西藥用植物園）、闊葉十大功勞M. bealei（采集于中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所）、靖西全緣葉十大功勞M. jingxiensis（采集于廣西那坡縣）、長(zhǎng)柱十大功勞M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功勞M. subimbricata W.Y. Chun et F. Chun（采集于廣西凌云縣），采集其新鮮葉樣品后迅速用硅膠干燥保存。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 引物合成與篩選 50條Sangon隨機(jī)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，50條Operons隨機(jī)引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。從中篩選出21條能擴(kuò)增出清晰條帶、重現(xiàn)性好的引物用于RAPD分析。引物序列見(jiàn)表1。

1. 2. 2 DNA提取及檢測(cè) 采用DNeasy Plant Mini Kit（德國(guó)QIAGEN公司）的方法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA提取。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，用酶標(biāo)儀測(cè)定260和280 nm下的OD值，檢測(cè)DNA的純度和濃度，稀釋成約20.0 ng/μL備用。

1. 2. 3 RAPD反應(yīng)程序及擴(kuò)增條件建立 經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索、正交優(yōu)化，確定RAPD-PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中包括10×Pfu Buffer 2.5 μL（Thermo公司）， MgSO4 2.5 μL（Thermo公司，濃度為25 mmol/L），dNTP 0.5 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司，濃度10 mmol/L]， Pfu DNA Polymerase 0.5 μL（Thermo公司，濃度2.5 U/μL），隨機(jī)引物1.0 μL，模板1.0 μL和ddH2O 17.0 μL。擴(kuò)增程序：95.0 ℃預(yù)變性4 min；95.0 ℃ 1 min，35.4 ℃ 1 min，72.0 ℃ 2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72.0 ℃ 延伸10 min。

RAPD-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠膠（含Goldview I型核酸染色劑）電泳，電壓80 V，電泳時(shí)間40 min。用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。將電泳圖譜中有清晰條帶且具有重現(xiàn)性的記為1，沒(méi)有條帶或重現(xiàn)性不好的記為0，得到由1和0組成的數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)單位引物擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，并計(jì)算多態(tài)性條帶百分率。

多態(tài)性條帶百分率（%）=多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用NTSYS-pc Version 2.11a進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算6個(gè)種間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient，GSC），用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（Unweighted pair group mean average，UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，并生成聚類(lèi)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DNA提取結(jié)果

十大功勞屬6個(gè)種葉片樣品提取的DNA經(jīng)檢測(cè)A260/A280為1.7～1.9，說(shuō)明樣品的DNA純度較高。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，DNA分子量均在20 kb左右，無(wú)明顯降解現(xiàn)象。

2. 2 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

21條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出264條條帶，其中多態(tài)性條帶234條，多態(tài)性比例為88.64%，表明選取的十大功勞屬6個(gè)種具有較豐富的遺傳多樣性。不同引物擴(kuò)增獲得的DNA條帶數(shù)不同，平均每條引物產(chǎn)生12.57條條帶，其中引物OPA9擴(kuò)增的條帶最多，為21條，引物S99和OPB5最少，僅3條（表1）。這些擴(kuò)增條帶大小為200～2000 bp。圖2為引物S32和OPB4的RAPD擴(kuò)增圖譜。

參考Roldán-Ruiz等（2000）的方法分析多態(tài)性條帶的分布規(guī)律，計(jì)算多態(tài)性信息含量（Polymorphic information content，PIC）。從圖3可以看出，十大功勞屬6個(gè)種的平均PIC為：小果十大功勞0.414，細(xì)葉十大功勞0.412，闊葉十大功勞0.407，靖西十大功勞0.398，靖西全緣葉十大功勞0.396，長(zhǎng)柱十大功勞0.373。

2. 3 遺傳相似性評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)21條引物擴(kuò)增得到條帶用NTSYS-pc Version 2.11a計(jì)算GSC（表2）。由表2可知，十大功勞屬6個(gè)種的GSC為0.45～0.78。其中靖西十大功勞和小果十大功勞的GSC最小，為0.45，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；闊葉十大功勞和小果十大功勞的GSC最大，為0.78，推測(cè)二者可能具有共同起源或?yàn)榻壠贩N，擁有相似的藥用成分。

2. 4 聚類(lèi)分析結(jié)果

運(yùn)用UPGMA法對(duì)十大功勞屬6個(gè)種的親緣關(guān)系進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到其聚類(lèi)樹(shù)。從圖4可以看出，在GSC為0.53處，6個(gè)種可分為3個(gè)組：闊葉十大功勞和小果十大功勞為一組，靖西全緣葉十大功勞為一組，其他3個(gè)種為一組；在GSC為0.59處，細(xì)葉十大功勞單獨(dú)為一組，長(zhǎng)柱十大功勞和靖西十大功勞為一組。

3 討論

植物DNA的提取要求采用新鮮、低溫冷凍或硅膠干燥保存的樣品，但在遠(yuǎn)距離采樣或采樣時(shí)受地形環(huán)境的限制等很難攜帶用于樣品保鮮的液氮或冰壺，因此，硅膠干燥保存法更加方便實(shí)用，且成本較低（李學(xué)營(yíng)等，2006）。本研究曾嘗試用CTAB法及國(guó)內(nèi)幾個(gè)試劑盒的方法提取硅膠干燥保存十大功勞屬6個(gè)種葉片的基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳并未見(jiàn)DNA條帶，增加水浴時(shí)間后，DNA降解十分嚴(yán)重，1.0%瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，與韓玉杰等（2008）的研究結(jié)果一致，難以提取獲得高質(zhì)量的DNA。這可能與十大功勞葉片組織含有較多的多糖及酚類(lèi)、色素等其他次生代謝產(chǎn)物且很難從破碎的植物細(xì)胞中抽提出來(lái)有關(guān)。改用德國(guó)QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit方法后，其提取液能充分破碎植物細(xì)胞，且采用特制的離心柱法能有效分離多糖及多酚等，最終可得到質(zhì)量較好的DNA。

一般來(lái)說(shuō)，RAPD擴(kuò)增產(chǎn)生的每條條帶即代表基因中的一個(gè)位點(diǎn)（楊瑞武等，2001）。本研究用21條RAPD引物共擴(kuò)增出264條條帶，意味著已經(jīng)對(duì)十大功勞屬6個(gè)品種基因組的264個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了檢查。264條條帶中只有30條條帶為十大功勞屬6個(gè)種所共有，十大功勞屬6個(gè)種的PIC為0.373～0.414，說(shuō)明十大功勞屬6個(gè)種存在較豐富的遺傳多樣性。十大功勞屬6個(gè)種的GSC為0.45～0.78，其中闊葉十大功勞和小果十大功勞的GSC最大，為0.78，推斷二者可能具有共同起源或?yàn)榻壠贩N，因此，可以考慮將小果十大功勞作為闊葉十大功勞的替代品用作藥材，但其藥效學(xué)、毒理學(xué)研究還需進(jìn)一步證實(shí)。

以RAPD數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的聚類(lèi)分析是植物分類(lèi)鑒別的重要依據(jù)。王艇等（2001）通過(guò)RAPD數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建了小檗屬、十大功勞屬等5個(gè)屬6種植物的聚類(lèi)分析圖，結(jié)果顯示闊葉十大功勞是獨(dú)立的一個(gè)屬，與小檗屬的綠葉小檗、貓兒刺不能聚為一類(lèi)，說(shuō)明在小檗科內(nèi)建立十大功勞屬較合理。本研究中的聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，在GSC為0.53時(shí)，十大功勞屬6個(gè)種可分為3個(gè)組：闊葉十大功勞和小果十大功勞為一組，靖西全緣葉十大功勞為一組，其他3個(gè)種為一組；當(dāng)GSC為0.59時(shí)，細(xì)葉十大功勞單獨(dú)為一組，長(zhǎng)柱十大功勞和靖西十大功勞為一組。這與對(duì)十大功勞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（Wu et al.，2009）既有一致性也存在一定差異。闊葉十大功勞和小果十大功勞葉片形態(tài)相似，葉緣有粗大的刺鋸齒，二者聚為一組與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果基本相符；靖西全緣葉十大功勞葉片全緣無(wú)鋸齒，與其他品種有顯著區(qū)別，將其聚為獨(dú)立的一組有一定的合理性；長(zhǎng)柱十大功勞的花柱長(zhǎng)達(dá)3 mm，花序長(zhǎng)8～30 cm（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，2001），與其他品種有明顯區(qū)別，可獨(dú)立為一組，將其與靖西十大功勞聚在一起，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果比較存在一定的偏差。

RAPD分析標(biāo)記技術(shù)存在一些不足，其中最突出的是穩(wěn)定性較差，本研究通過(guò)嚴(yán)格控制RAPD-PCR反應(yīng)酶、模板DNA、dNTP及Mg2+等關(guān)鍵因素的質(zhì)量，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索、正交優(yōu)化，確定RAPD-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?qū)?00條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，最終得到較穩(wěn)定且可重現(xiàn)的分析結(jié)果。可見(jiàn)，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)能較好地應(yīng)用于對(duì)十大功勞植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系的分析。

4 結(jié)論

十大功勞屬6個(gè)種植物具有較豐富的遺傳多樣性，部分種之間親緣關(guān)系較近，可作為今后開(kāi)展人工選育優(yōu)質(zhì)十大功勞藥材研究的參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 思利華）