賈彩紅 王卓 李健平 金志強(qiáng) 徐碧玉

摘 要 MLO基因是一類植物特有的抗病基因，為了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用，利用RACE技術(shù)從香蕉中克隆獲得了香蕉2條MLO基因，分別命名為MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明，MaMLO1的開放閱讀框?yàn)? 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸；MaMLO2的開放閱讀框?yàn)? 689 bp，編碼562個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，MaMLO1與已登錄的香蕉MLO1（XP_009413424）親緣關(guān)系較近，MaMLO2與已登錄的香蕉MLO6（XP_009411538）親緣關(guān)系較近。組織特異性研究表明，這2個(gè)基因在香蕉各器官中均有表達(dá)，但MaMLO2在根中的表達(dá)量最大。不同激素處理下的研究表明，MaMLO1受ABA、乙烯和水楊酸誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，受茉莉酸誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)；MaMLO2受ABA、乙烯、水楊酸和茉莉酸4種激素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。在感病品種中2個(gè)基因均是下調(diào)表達(dá)，在抗病品種中均是上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明，克隆到的2條MLO在感病品種中沒有參與到香蕉抗枯萎病的過程，而在抗病品種中參與了香蕉抗枯萎病的過程。

關(guān)鍵詞 香蕉；MaMLO基因；克隆；表達(dá)分析

中圖分類號 S668.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract MLO is a kind of disease resistance genes in plant. In order to study the role of MaMLO in banana blight resistance， two MaMLOs named MaMLO1 and MaMLO2 were cloned from banana using the RACE technology. Sequence analysis showed that MaMLO1 had an open reading frame of 1 473 bp， encoding 490 amino acids； MaMLO2 had an open reading frame of 1 689 bp， encoding 562 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that MaMLO1 was close affinity to MLO1（XP_009413424）， MaMLO2 was close affinity to MLO6（XP_009411538）. Tissue specificity study showed that the two genes expressed in all organs of banana， but the biggest expression quantity of MaMLO2 was in the root. The study showed that the expression of MaMLO1 was induced to raise by ABA， ethylene and salicylic acid， while was induced to reduce by jasmonic acid； The expression of MaMLO2 was induced to raise by ABA， ethylene， salicylic acid and jasmonic acid. The expression of MaMLO1 and MaMLO2 was induced to reduce in cultivars， but raised in disease-resistant varieties. The results showed that the two MaMLOs were not involved in the process of the banana cultivars blight resistance， but they involved in resistant varieties.

Key words Banana； MaMLO； Cloning； Gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.007

香蕉是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家重要的農(nóng)作物之一。其果實(shí)由于富含豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，是一些熱帶地區(qū)人民的主要糧食和國民收入的主要來源[1]。而香蕉枯萎病被認(rèn)為是香蕉的“癌癥”，嚴(yán)重影響著香蕉的產(chǎn)量和質(zhì)量。香蕉枯萎病是一種典型的土傳病害，是世界范圍內(nèi)限制香蕉種植和產(chǎn)量的主要原因。該病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. Cubense，F(xiàn)oc）引起的毀滅性土傳維管束病害，廣泛分布于世界各大香蕉主產(chǎn)區(qū)。香蕉易感枯萎病的機(jī)理十分復(fù)雜，其研究涉及到病理學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科。有研究顯示枯萎病的發(fā)生是由于病原菌通過根系侵入植株輸導(dǎo)組織，病原體在木質(zhì)部的導(dǎo)管中大量繁殖，這些繁殖體可以在蒸騰壓力的作用下隨導(dǎo)管運(yùn)輸，隨著病原體的大量增殖，增殖的病原菌體可由一個(gè)導(dǎo)管運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)導(dǎo)管，大量繁殖的病原菌在導(dǎo)管內(nèi)形成凝膠體，受感染的宿主分泌酚類化合物使堵塞的導(dǎo)管木質(zhì)化而死亡[2]。

MLO基因家族是一類植物特有的抗病基因，是一個(gè)多基因家族，MLO基因?qū)χ参锏目共∵^程起負(fù)調(diào)控作用，在一定程度上相當(dāng)于植物“感病”基因。任何感病的野生型（MLO）都可以通過誘變獲得MLO抗性。因此這類基因在改善植物抗性方面具有更大的潛力和應(yīng)用前景。不同植物中的MLO基因拷貝數(shù)不同，擬南芥有15個(gè)[3]，水稻有12個(gè)[4]，高粱有13個(gè)[5]，葡萄有17個(gè)[6]，黃瓜有14個(gè)[7]。對不同物種的MLO基因結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MLO是一類比較保守的抗病基因。近年來部分物種的MLO基因在抗病中的功能已經(jīng)得到驗(yàn)證，包括水稻[8]、小麥[8-9]、擬南芥[10-11]、辣椒[12]等。

目前對MLO基因的研究主要集中在與白粉病相關(guān)的研究，而未見與香蕉枯萎病的相關(guān)報(bào)道，與激素、非生物脅迫相關(guān)的研究報(bào)道也較少。本研究從枯萎病菌（尖孢鐮刀菌生理4號小種）處理的巴西蕉根轉(zhuǎn)錄組中獲得了2個(gè)MLO基因片段，通過RACE技術(shù)從香蕉中獲得2條MLO基因全長序列，對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對在不同激素處理、香蕉感病品種和抗病品種中的表達(dá)進(jìn)行分析研究，以期為香蕉MLO基因在香蕉抗病分子育種中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉（Musa acuminate L. AAA group cv. Brazilian）的根、莖、葉、花和果實(shí)（開花后100～120 d）從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所澄邁香蕉種植園獲得。五葉一心的巴西蕉和抗病品種GCTCV119（M. acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）從儋州香蕉組培苗廠購買獲得。

1.2 方法

1.2.1 激素處理 選取生長勢一致的五葉一心的巴西蕉，用100 mol/L的ABA溶液，100 mol/L的茉莉酸溶液，100 mol/L水楊酸溶液和1%（V/V）乙烯利溶液處理24 h后取樣，分別在0、6、12、24 h取樣，液氮速凍后于-70 ℃冰箱待用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌液處理 分別選取生長勢一致的感病品種巴西蕉和抗病品種GCTCV119，利用Foc TR4侵染香蕉，香蕉植株在Foc TR4濃度為1.5×106 condia/mL的孢子懸浮液中浸泡2 h后，置于與上述培養(yǎng)條件相同的環(huán)境中培養(yǎng)，分別在0、2、4、6 d取樣（DPI）[13]，液氮速凍后保存于-70 ℃冰箱待用。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 香蕉各種組織RNA的提取采用改良的CTAB法[14]。每個(gè)樣品取4 μg RNA，利用Invitrogen SuperScript TM IIIReverse Transcriptase合成cDNA第一鏈，具體反應(yīng)體系和操作根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.2.4 香蕉MaMLO基因的克隆 RACE方法克隆香蕉中的MaMLO，根據(jù)已獲得的3′端完整的cDNA片段設(shè)計(jì)5′端引物（表1）。SMART RACE Kit 擴(kuò)增5′端序列。拼接后，設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物（表1）利用香蕉根系cDNA文庫擴(kuò)增全長序列。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性7 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。獲得的序列利用BLASTn進(jìn)行分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn），推導(dǎo)的氨基酸序列與香蕉DH-Pahang（AA組）基因組數(shù)據(jù)庫（http：//banana-genome.cirad.fr/greenphyl）進(jìn)行比對，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建使用MEGA4[15]。

1.2.5 半定量RT-PCR 利用半定量RT-PCR對MaMLO基因在香蕉不同器官中的表達(dá)進(jìn)行分析。所需引物見表1。PCR反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。MaActin作為內(nèi)對照，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.6 熒光定量PCR 利用熒光定量PCR對MaMLO基因在枯萎病菌下處理后的表達(dá)進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為：12.5 μL的2XSYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的ROX，100 ng的反轉(zhuǎn)錄RNA。所需引物見表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃變性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。MaActin作為內(nèi)對照，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的特征分析

對獲得的基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MaMLO1基因的開放閱讀框?yàn)? 473 bp，編碼490個(gè)氨基酸，MaMLO2基因的開放閱讀框?yàn)? 689 bp，編碼562個(gè)氨基酸，這2條基因中均含有7個(gè)跨膜區(qū)，符合MLO基因的典型特征（圖1），因此將其命名為MaMLO。將克隆獲得的基因與2A基因組中的MLO基因進(jìn)行比對，本研究中克隆獲得的MaMLO1基因與已經(jīng)登錄的香蕉中的MLO1基因在核苷酸水平上的同源性為99.39%，氨基酸水平上的同源性為94.69%；與2A基因組中的MLO基因核苷酸水平上同源性為94.69%，氨基酸水平上的同源性為98.78%，MaMLO2與2A基因組中的MLO基因核苷酸水平上同源性為99.35%，氨基酸水平上的同源性為99.11%，與NCBI中已登錄的MLO6基因核苷酸水平上同源性為99.35%，氨基酸水平上的同源性為99.11%（表2）。說明克隆得到的這兩個(gè)基因是香蕉中的MLO基因。

構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，MaMLO1與已經(jīng)登錄的香蕉中的MLO遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，與其他植物中的MLO的遺傳關(guān)系也比較近；而MaMLO2與已登錄的香蕉中的MLO6在同一分支上，與香蕉中MaMLO1遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他植物中的MLO遺傳關(guān)系也較遠(yuǎn)（圖2）。

2.2 基因的器官特異性表達(dá)

利用半定量RT-PCR對MaMLO1和MaMLO2在香蕉不同器官中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，MaMLO1在根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)，但表達(dá)量變化不明顯，MaMLO2在根中的表達(dá)量最大，在莖、葉、花和果中的表達(dá)量基本一致（圖3）。

2.3 不同激素處理下的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)對MaMLO1和MaMLO2在不同激素處理后根中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MaMLO1受ABA和乙烯脅迫均是先下調(diào)表達(dá)，隨后上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)情況成“V”字形狀；而在水楊酸脅迫下是先上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)表達(dá)，在12 h其表達(dá)量最大，相對表達(dá)量為2.87；在茉莉酸脅迫下，其表達(dá)是下調(diào)的。MaMLO2均受ABA、乙烯、水楊酸和茉莉酸4種激素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量變化顯著，ABA、乙烯和茉莉酸誘導(dǎo)相對表達(dá)量最大值均出現(xiàn)在24時(shí)，分別為5.90、27.89、和18.95，而水楊酸誘導(dǎo)的最大值出現(xiàn)在12時(shí)，其相對表達(dá)量最大值為17.46（圖4）。

2.4 不同香蕉品種中的表達(dá)分析

對MaMLO1和MaMLO2在香蕉感病品種和抗病品種接種Foc TR4后的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在感病品種2個(gè)基因均是誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，且下調(diào)表達(dá)量均呈極顯著差異，MaMLO2下調(diào)表達(dá)量比MaMLO1的下調(diào)表達(dá)量更大，MaMLO1的最小相對表達(dá)量為0.19，MaMLO2的最小相對表達(dá)量為0.13。在抗病品種中，這2個(gè)基因均是誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，MaMLO1的相對表達(dá)量變化不明顯，MaMLO2的相對表達(dá)量變化在2 d和6 d呈極顯著差異，在4 d呈顯著差異，且最大值出現(xiàn)在6 d，為3.05（圖5）。

3 討論與結(jié)論

自從MLO基因在大麥中被發(fā)現(xiàn)以來，人們陸續(xù)在很多作物中發(fā)現(xiàn)了MLO基因，而原核生物、酵母和動物中均未發(fā)現(xiàn)該類基因的存在，說明MLO基因是植物所特有的。已有研究成果表明，MLO在許多作物里呈家族形式，具有多個(gè)家族成員，其中擬南芥中有15個(gè)家族成員、玉米中有9個(gè)、水稻中有12個(gè)家族成員，而在測序的香蕉2A基因組中有24個(gè)。研究中，克隆了香蕉中的2個(gè)MLO基因，推導(dǎo)的氨基酸編碼的MLO蛋白均具有跨膜結(jié)構(gòu)，滿足MLO基因的基本特征；系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，本研究中克隆的MLO基因與NCBI中已登錄的香蕉MLO1基因和MLO6基因的同源性分別為99.39%和99.35%，但2個(gè)基因的長度不同，氨基酸同源性也較低，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，表明這2個(gè)基因?qū)儆诓煌膩喖易?，MaMLO1和MaMLO2在香蕉中所起的作用可能不同。

利用半定量PCR研究香蕉中的MLO基因在不同器官中的表達(dá)，MaMLO1在香蕉的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)，但在各組織中的表達(dá)量差別不明顯，而MaMLO2在根中的表達(dá)量較高，在其他器官中的表達(dá)量相對較低，說明該基因?qū)儆诮M織特異性表達(dá)模式，可能與香蕉枯萎病相關(guān)。蘋果中與白粉病相關(guān)的MLO基因，其表達(dá)量在根中最大[23]，本研究結(jié)果與其有相似之處，即與病相關(guān)的MLO基因在根中的表達(dá)量最大，但蘋果白粉病是發(fā)生在葉片上，而香蕉枯萎病發(fā)生在根系中，其不同之處需進(jìn)一步研究證明。

目前已有關(guān)于MLO基因在不同激素處理、不同脅迫處理后表達(dá)情況的研究報(bào)道。例如：小麥[16]、水稻[17]、甜瓜[18]、辣椒[19]和葡萄[20]中均有報(bào)道。辣椒中的MLO基因，受黃單胞菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在水楊酸、甲基紫精、氯化鈉和干旱處理后，其表達(dá)量也上調(diào)，但茉莉酸處理的其表達(dá)量下調(diào)[19]。說明辣椒的MLO基因不僅參與了抗病途徑，在非生物脅迫和激素脅迫方面也起作用。葡萄中不同的MLO基因，在傷害處理、水楊酸處理和雙氧水處理后，不同的MLO基因的表達(dá)模式不同，有的上調(diào)，有的下調(diào)，說明植物體內(nèi)不同的MLO基因所起的作用不同[20]。本研究中香蕉中的MaMLO1和MaMLO2基因在不同激素處理后的表達(dá)模式有所不同，表明這2個(gè)基因在香蕉中對激素的反應(yīng)不同。這與在辣椒和葡萄中的研究相似，即不同的MLO基因在植物體內(nèi)所起的作用不同，說明不同植物中的MLO基因?qū)Σ煌{迫處理的反應(yīng)不同，所起的作用也不同。本研究中香蕉的2個(gè)MLO基因在4種激素處理后的表達(dá)結(jié)果說明，MaMLO2基因響應(yīng)不同激素的程度均大于MaMLO1基因，說明在香蕉對外界激素反應(yīng)強(qiáng)度方面，MaMLO2基因?qū)に氐姆磻?yīng)程度大于MaMLO基因，表明在香蕉反應(yīng)激素方面MaMLO2的作用大于MaMLO1的作用。以上結(jié)果表明，植物的MLO基因不只與植物的抗病相關(guān)，可能與植物的非生物脅迫、植物的生長發(fā)育有關(guān)，體現(xiàn)了MLO基因功能上的多效性。

已有研究表明，MLO基因?qū)儆诳共』?，在抗病過程中起負(fù)調(diào)控作用，小麥中的感病品種用白粉病菌處理后MLO基因的表達(dá)量在24 h后開始上升，72 h達(dá)到高峰，而在抗病品種中其表達(dá)量在18 h即出現(xiàn)了表達(dá)高峰，表明在抗病品種中MLO基因可能直接參與了抗病反應(yīng)[21]。在蘋果中研究發(fā)現(xiàn)，在感染白粉病的莖段和葉中其表達(dá)量比健康的莖段和葉中表達(dá)量均有所增加[22]，這與我們的研究結(jié)果不同。本研究中發(fā)現(xiàn)，香蕉的感病品種和抗病品種用枯萎病菌處理后，在感病品種中，2個(gè)MLO基因的表達(dá)量下調(diào)，而在抗病品種中2個(gè)MLO基因的表達(dá)量上調(diào)，說明在香蕉感病品種中這2個(gè)MLO基因可能沒有參與到抗病反應(yīng)中，而在抗病品種中可能參與了抗病反應(yīng)，這與小麥中的研究結(jié)果不同。在香蕉感病品種中，MLO基因的表達(dá)量一直是下調(diào)，在抗病品種中一直上調(diào)，而在小麥感病品種和抗病品種中都是先上調(diào)隨后下調(diào)，這可能與不同的植物病害有關(guān)，白粉病是發(fā)生在葉片上的一種病害，而枯萎病是發(fā)生在根系中的一種病害，2種病害發(fā)生機(jī)制不同，推測MLO基因在不同的抗病途徑中所起的作用不同，小麥中的TaMLO8基因在小麥條銹病和白粉病兩種病害系統(tǒng)中所起的作用不同[23]也證明了這一點(diǎn)，但還需要進(jìn)一步的研究證明。

本研究從香蕉中獲得了2條MLO基因，對其基因和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了一些分析，對其組織研究表明，這2個(gè)基因參與了香蕉的生長發(fā)育過程；其對不同激素脅迫和香蕉枯萎病的響應(yīng)說明這2個(gè)基因不僅響應(yīng)非生物脅迫，而且響應(yīng)生物脅迫。

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